平定吴楚叛乱以后，周亚夫回到长安继续任太尉。景帝七年（公元前150年）二月，景帝升任周亚夫为丞相，对他十分器重。
正是周亚夫任丞相时，麻烦事就来了。就在这年，景帝想要废掉栗太子，另立刘彻（即后世汉武帝）为太子，周亚夫强烈反对，景帝不听，因此景帝就逐渐疏远周亚夫。梁孝王刘武每次到长安朝见时，常在窦太后面前说周亚夫的坏话。
这时，景帝的生母窦太后要封王皇后的哥哥王信为侯，希望景帝照办。景帝表示谦让地说：“太后的侄儿南皮侯窦彭祖、太后的弟弟章武侯窦广国，先帝（文帝）都没有给他们封侯，等到我即位以后才封他们做侯。王信看来还不能封侯呢！”窦太后说：“做皇帝的各自按照当时情况办事罢了。我哥哥窦长君在世时不能封侯，死后他儿子彭祖反而得到了侯爵，我对这事感到非常遗憾。你赶快封王信为侯吧！”景帝说要同丞相周亚夫商量。周亚夫毫不含糊地说：“过去高皇帝（指汉高祖刘邦）规定：‘不是姓刘的不许封王，没有立功的不能封侯。谁如果违反规定，天下人就应共同讨伐他’。现在王信虽然是皇后的哥哥，但没有立功。给他封侯，不合规定。”景帝听了默然不语，放下了这件事，也没给王信封侯。窦太后自然记恨在心。景帝其实也不高兴。
到了汉景帝中元三年（公元前147年），匈奴王惟徐卢等五人投降汉朝，景帝准备封他们为侯，以便吸引更多的人来归降。这时周亚夫又出来反对，他对景帝说：“他们背叛自己的君主来投降陛下，陛下却封他们为侯，那么今后还怎么责罚那些不守节操的臣子呢？”这个意见提得确实尖锐，但其本意却是一片忠心。景帝不听，认为“丞相的建议不可采用”，否定了周亚夫的意见，仍然封惟徐卢等人为列侯。周亚夫见自己提的意见没被采纳，就称病不朝。景帝见周亚夫老是顶撞自己，就趁此机会，免了他的丞相职务。
景帝显然不像文帝那样宽厚，对周亚夫不奉诏救梁国，他早就心怀不满。后来战争胜利了，周亚夫立了大功，梁国也完好无损，这证明周亚夫的战略是正确的，景帝也就不再责备周亚夫，但心里总是不喜欢他。周亚夫做了丞相后，又一而再、再而三地反对景帝的主张，虽然是出于一片忠心，但景帝却觉得不能容忍。他免了周亚夫的丞相职务还不算，还要进一步迫害他，必欲置之于死地而后快。
周亚夫为人刚直不阿，虽被罢相，也还要保持自己的尊严。有一次，景帝在宫中召见周亚夫，赏赐食物。当时在周亚夫的席上只放了一大块没有切开的肉，又没有放筷子。周亚夫心里不高兴，就向主管酒席的官员要筷子。景帝看了笑着对他说：“你对此还不满足吗？”周亚夫就脱帽谢罪。景帝叫他起来，他便快步走了出去，不辞而别。景帝两眼直盯着他出去，说：“这个心里不服气的儿是不能做少主（指太子刘彻）的臣子的啊！”
时隔不久，周亚夫的儿子为他父亲向工官买了五百件皇家殉葬用的铠甲盾牌，准备作为殉葬品。儿子雇人搬运，却不给工钱。雇工就上告，说周亚夫的儿子盗买官府的器具，案情牵涉到周亚夫。状子到了景帝手里，他见是个好机会，可以治周亚夫的罪，就下令让官吏查究。官吏按文书上的罪状审问时，周亚夫拒不回答，什么口供也得不到。报到景帝那里，景帝非常恼火，骂道：“朕不任用他了。”并下令把案子交给执法宫廷尉审理。廷尉十分领会皇上的意思，是要把周亚夫置于死地，于是下令逮捕他。周亚夫知道后，想要自杀，夫人急忙阻止，没有死，就被廷尉逮捕起来了。廷尉责问周亚夫说：“您要谋反吗？”周亚夫说：“我所买的兵器都是殉葬品，怎么能说是要谋反呢？”参加审问的一位官吏说：“您即使不在地上造反，也是要到地下造反哩！”这样官吏的逼讯越来越紧。周亚夫一生忠直，哪里能忍受这样的冤屈呢？气愤之下，绝食五天，吐血而死。死时正值景帝后元元年（公元前143年）。景帝知道周亚夫已死，立即下令除掉条侯的封国。接着，景帝又封王信为盖侯，这时再也没有人敢反对了。
周勃、周亚夫父子都曾出将入相，为西汉王朝的建立和巩固建立了不可磨灭的功勋。早年，周勃追随汉高祖刘邦南征北战，继而平定诸吕之乱；周亚夫治军严谨，不失其文风范，继之扫平“七国之乱”。他们忠贞报国，憨厚质朴，都曾因权重震主而遭嫌疑，但在不同帝王手下，结局却有如此大的差异。在和平年代，他们的作用已不是那么显要了，于是，“兔死狗烹，鸟尽弓藏”，也该轮到帝王们抖狠了。依此看来，封建社会的所谓“忠君报国”，实在是令人望而却步！