根据微生物的种属不同，认为存在三种不同的产氢机制，丙酮酸脱羧产氢，辅酶氧化还原平衡调节产氢和产氢气乙酸菌产氢。许多细菌可依靠混合酸发酵或2，3-丁二醇发酵代谢途径，分解甲酸产氢。产氢发酵菌可通过丙酮酸脱羧提供甲酸。
丙酮酸在丙酮酸脱羧、甲酸裂解酶作用下产生甲酸，甲酸分解过程的电子经铁氧化还原蛋白传递给氢酶，由氢酶还原质子产生分子氢。该产氢机制涉及到方程如下：
CH3COCOOH+HSCoACH3COSCoA+HCOOH(4—27)
CH3COSCoA+H2OCH3COOH+HSCoA(4—28)
HCOOHH2+CO2(4—29)
丙酮酸在丙酮酸脱氢酶作用下脱羧；形成硫胺素焦磷酸一酶的复合物，同时将电子转移给铁氧化还原蛋白Fd，并传递至氢酶，还原质子产生分子氢。
上述两种产氢机制均与丙酮酸脱羧相关，前一种机制多发生于肠道杆菌型产氢发酵菌；后一种机制见于梭状芽孢秆菌型产氢菌。
微生物体内的葡萄糖在酵解过程中生成还原型辅酶Ⅰ(NADH)和质子，NADH可通过氢酶的催化氧化，转化为氧化型辅酶，同时释放氢气。这即是辅酶Ⅰ产氢机制。其产氢方程如下：
C6H12O2+2NAD+2CH3COCOOH+2NADH+2H+(4—30)
NADH+2H+H2+NAD+(4—31)
辅酶Ⅰ与质子的氧化还原反应与微生物体内的氢酶相关。Adams在大肠杆菌体内发现了膜基氢酶，由相对分子质量为11．3万的两个亚基组成，其中一个亚基与氢的释放有关，释氢反应的最适pH值为6．5，另一亚基与氢的吸收有关，最适pH值为8．5。两个亚基的活性中心分别位于细胞膜两侧。
NADH的形成与发酵产生乙酸、丁酸、丁二醇、丙酮相关联；同时在微生物发酵过程中，己烷单磷酸盐代谢将通过NADH氧化消耗CO2，产生甲酸、琥珀酸类产物。用于产氢的NADH将是其生成与消耗的剩余量。因此，微生物发酵产氢量将随NADH被还原产物增加而增加，因NADH氧化产物的增加而减少。同时发酵过程CO2的分离或除去将促进产氢。
存在一类产氢产乙酸细菌能将发酵中产生的丙酸、丁酸、戊酸、乳酸、乙醇等进一步转化为乙酸，同时产生氢气。这类细菌为严格厌氧菌和兼性厌氧菌，目前仅有少数被分离，现将相关菌株及其产氢反应列于表4—1。
产氨产乙酸菌及产氢反应
菌名产氢反应S′菌CH3CH2OH+H2OCH3COOH+2H2沃尔夫互营单胞菌2CH3CH2COOH+2H2O3CH3COOH+2H2专性厌氧沃林互营杆菌CH3CH2COOH+2H2OCH3COOH+3H2+CO3。
2.暗发酵产氢的进展
涉及暗发酵产氢的菌种极多，大量的研究工作与发酵菌株的筛选利用有关，朱核光等将暗发酵细菌归纳为厌氧菌、兼性厌氧菌、好氧菌三大类。
(1)厌氧菌。用于生物产氢研究的厌氧微生物大致可以分成以下5种类型。①梭菌(clostridia)。通过葡萄糖的酵解产氢，其反应式如下：
葡萄糖2H2+丁酸+2CO2(4—32)
葡萄糖+2H2O4H2+2乙酸+2CO2(4-33)
发酵过程中产生的丁酸和乙酸的比例决定了从葡萄糖发酵产H2的量。早在20世纪60年代初，Magna公司就以C．butyricurn和C．welchii用10L发酵罐生产出了H2。Rohrback等试图通过固定在琼脂中的C．butyricum细胞以酒厂的废水为原料生产的H2启动燃料电池。该电池以15mA的电流持续工作了20天。②甲基营养型细菌(Methylotrophs)。1979年Egorov等首先从一种甲基营养型细菌中分离了NAD依赖型甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase，简称FDH)，并揭示了可以用这个系统从甲烷产生NADH或H2。③产甲烷细菌。Zehnder等分离了一株产甲烷细菌，它能降解甲酸形成CO2和H2。④瘤胃细菌(Rumen bacteria)。白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)是一种能够水解纤维素的厌氧瘤胃细菌。它通过分解碳水化合物生成乙酸、乙醇、甲酸、H2和CO2。Innotti等以葡萄糖为原料连续培养R．albus产生H2。培养过程中，每100mol的葡萄糖生成了65mol乙醇、74mol乙酸和237mol H2。⑤古细菌(Ar—chaea)。嗜热古细菌中的激烈热球菌(Pyrococcus fusiosus)含有一种可溶性的含镍HD，能利用碳水化合物和蛋白质生成H2。
(2)兼性厌氧菌。大肠杆菌与肠细菌均属兼性厌氧产氢菌。甲酸氢解酶可以催化如下反应：
HCOO-+H2OH2+HCO-4(4-34)
此反应可利用甲酸产H2，也可用于催化逆反应。Nandi等固定化E．coli的FHL系统，持续地将甲酸转化为H2和CO2。Tanisho等分离到一株产气肠杆菡(Enterobacter aerogenes)，在38℃～40℃下该菌能够在含葡萄糖、酪蛋白和盐的培养基上产H2。最大产H2能力是每小时每升培养基产H2O0.0089～0．0093mol。经优化，23h内平均产氢速率为0．0232mol H2／(L·h)。
(3)好氧菌。好氧氢细菌能够利用H2和CO2作为唯一能源和碳源自养生长。它们含有一种可溶性的可还原NAD的HD。这类菌也能异养生长。Kuhn等发现了异养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)在厌氧条件下利用葡萄糖或果糖异养生长并分解有机物放H2。A．eutrophus含有一种还原NAD的HD，它能够在厌氧条件下利用多余的还原力释放H2。有机底物产生的电子流并不进入呼吸链。Klibanov等将A．eutrophus固定化后对可逆反应：
HCOOHH2+CO2(4—35)
进行了研究。虽然固定化细胞具有很高的稳定性，但并未表明固定化细胞可以持续降解甲酸。Kalia等从产氢细菌培养基中分离出一种产H2的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheni fotrois)。在3％的葡萄糖培养基中批量培养，24h内每摩尔葡萄糖可以产H2O．58mol。
暗发酵微生物具有可降解大分子有机物产氢的特点，从而在生物质转化产氢中具有优势。Suzuki用琼脂固定化C．butyrium菌株，用于糖基酒精废水产氢，是代表性的研究。任南琪等以厌氧活性污泥为生物催化剂用于有机废水制氢，得到10．4m3H2／(m3·d)的最大产氢速率，且已具备工业化规模产氢的基础。
五、生物水气转换(BWGS)制氢
水气转换(water gas shift)是CO与H2O转换为CO2和H2的反应式(4-23)。以甲烷或水煤气为起点的制氢工业均涉及CO的转换，因此水气转换是工业制氢的一个基础反应。水气转换属放热反应，高温不利于氢的生成，然而高温有利于动力学速率的提高，因此，工业水气转换通常在350℃～370℃或200℃～220℃下进行，前者称为高温转换(HTS)，后者为低温转换(LTS)。
一种无硫的紫色光合细菌，能在厌氧条件及环境温度下催化上述水气转换反应，且对原料气有较低的要求，从而提供了利用合成气转换制氢的新途径。探索这种途径能否成为经济可行的制氢技术即是生物水气转换(BWGS)研究的目标和内容。
Amos对BWGS过程的基本特征做了较系统的描述。光合细菌Rx．gelatinousus CBS为维持生长和代谢，能利用光合作用，好氧异养代谢获得能量。而在厌氧暗培养条件下，该类细菌则可利用CO为碳源，通过厌氧发酵途径获得能量，同时完成水气转换过程。与前两种途径相比较，BWGS过程所提供的能量很小，从而使微生物处于缓慢生长的状态。在这种状态下，微生物产生的废弃物与废弃生物量也很少。只要微生物的生长速率大于其自然死亡的速率，使系统中维持有足够量的活细胞，微生物即能以CO为碳源继续生长，同时使BWGS过程长时间地发生。
为保证有足够的生物量，可通过提供氧气、醋酸、苹果酸等营养盐，促进微生物的快速生长；并通过厌氧及CO的引入，诱导或启动BWGS过程的产生。
pH值、温度的变化与扰动会导致细胞的死亡和BWGS过程的终止，可通过调整pH值、温度并提供上述快速生长的条件，在系统稳定后重新启动BWGS过程。对Rx．gelatinousus CBS，其BWGS过程的适宜pH值为6．8～8，适宜温度为环境温度，不能大于37℃。
微生物的污染虽然对BWGS过程会有很大的影响。然而自然界中可利用CO作为碳源的微生物很少，因此只要严格控制培养条件，污染可以避免。
CO是BWGS过程的诱导剂和底物，也是BWGS反应的抑制物。当培养液CO浓度较高时，BwGs反应速率下降。作为一种难溶性的气体，CO从气相迁移入培养液中的传递速率很小，因此BWGs过程将表现为由反应速率与气液传递速率双重控制的稳态行为。
CO的气液传递速率可由式(4—36)表示。
N=kLa(C*co-Cco)(4—36)
式中，N为传递速率；kL为传递速率系数；a为气液交换面积；C*co为气液界面CO的平衡浓度；Cco为CO在液体本相浓度。
强化系统中的气液扰动，减小液体中CO气泡的粒径，提高系统中CO的气相分压可分别提高kL、a及C*co的数值，从而使传递速率曲线向右上方移动。
BWGS过程的反应速率与系统中细胞密度有关。一般情况下，提高细胞密度，可提高系统的水气转换速率。
从生化反应工程角度分析，BWGS反应属于溶解度偏低的气相反应物在液相中的均质催化过程，反应表现为典型的底物抑制动力学。为了提高．BWGS过程的效率，具有高转换效率、耐受较高操作压力、耐受较高浓度CO抑制微生物的构建，反应器及其相关工程、工艺基础的研究将是BWGS实用化研究的方向。
(第六节 )生物柴油简介
一、生物柴油的定义
美国材料与试验协会(ASTM)定义生物柴油是来自于可再生的油脂资源(如植物油脂或动物油脂)的长链脂肪酸甲酯。生物柴油是最重要的液体可再生能源产品之一，具有润滑性能好、储运安全、抗爆性好、燃烧充分等优良性能，还具有能量密度高、可再生、易生物降解、含硫量低等特点，可以作为优质的石化柴油代用品。