一、工业生产菌种的退化现象及原因
生产菌株遗传标记的丢失及生产能力的下降称为菌种退化（degeneration）。菌株产孢子能力、发酵主产物比例下降等也是菌种退化的表现。
在发酵工业中，菌种退化既可以是形态上的，也可以是生理上的。就产量性状而言，菌种的负突变就是退化；其他原有的典型性状变得不典型时，也是退化。最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变，例如苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的芽孢和伴孢晶体变得小而少等；其次，就是生长速度缓慢，产孢子越来越少，例如，细黄链霉菌（Streptomyces mi-croflavus）“5406”在平板培养基上菌苔变薄、生长缓慢，不再产生典型而丰富的橘红色分生孢子层，有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝；再次，则是代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降，比如赤霉素生产菌种藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）产赤霉素能力的下降，枯草杆菌（Bacillus subtilis）“B。F 7658”生产α-淀粉酶能力的衰退，以及白僵菌（Beauveri-abassiana）对宿主致病能力的下降等；最后，退化还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。
菌种退化是发生在细胞群体中的一个由量变到质变的逐渐演化过程。首先，在细胞群体中出现个别发生负突变的菌株，这时如不及时发现并采取有效的措施，而一味地移种传代，则群体中这种负突变个体的比例逐渐增大，最后占据了优势，整个群体发生严重的退化。所谓“纯”的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后来，整个菌种虽已“退化”，但也是不纯的，即其中还会有少数尚未退化的个体存在。
（一）菌种退化的原因
1.基因突变
菌种退化的主要原因就是那些控制生产性状的基因发生负突变。在生物进化过程中，遗传性变异是绝对的，而稳定是相对的；退化性变异是大量存在的，而进化性变异则是个别的。在自然条件下，个别适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向。在人为条件下，通过人工选择，有意识地筛选出个别正突变体用于生产实践；相反，如不自觉、认真地去选择，大量自发突变菌株就会趁机泛滥，最后导致菌种退化。
从生物体角度讲，生产实践中采用的优良菌株往往是不正常的，许多菌种是营养缺陷型，一旦发生回复突变，成为野生型，回到了正常的生理状态，生长力变得旺盛，在群体中就具有生长优势，随着传代次数的增加，回复突变菌株在数量上逐渐占据优势，成为主要菌株，但对生产而言则是菌种发生了退化。对于非营养缺陷型的生产菌，他们为了适应环境也可自发突变成为负突变的菌株。当这些负突变株在数量上占据优势时，势必造成菌种退化。由此可知基因突变是菌种退化的原因。
2.分离现象
遗传育种获得的菌种若是多核（或是单核）但DNA双链之一发生突变，随着传代，其生产性状也将发生退化。这种退化不是基因突变引起的，而是由于诱变获得的高产株本身不纯。高产突变只发生在一个核和一条DNA单链上，随着细胞分裂，核发生分离，突变基因和未突变基因发生分离，出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株。
退化是菌种自发突变的结果，培养环境营养不良、发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化。根据菌种退化原因分析，可以制定出一些防治退化的措施。
（二）菌种退化的防治
①从菌种选育方面考虑：在育种过程中，应尽可能使用孢子或单核菌株，避免对多核细胞进行处理；采用较高剂量使单链突变的同时，另一条单链也丧失模板作用，可以减少出现分离回复现象；同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证获得菌株的“纯度”。另外，增加突变位点的筛选，也能预防回复子，减少菌种退化的可能性。
②控制传代次数：有些发酵菌种，随着接种传代次数的增加，出现严重的退化现象。例如产腺苷的芽孢杆菌黄嘌呤营养缺陷型菌株，在总保藏时间相同的条件下，回复子的比例随传代次数的增加而增加，腺苷产量也随之下降。
由此可知，尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率，对发酵菌种是十分重要的。因此，任何较重要的菌种，都应采用一套相应的良好菌种保藏方法。
③创造良好的培养条件：创造一个适合原种的生长条件，可在一定程度上防止菌种的衰退。例如，在赤霉素生产菌Gebberella fiujikuroi的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5'-核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，有防止衰退效果；在进行Aspergillus terricola（栖土曲霉）3.942培养时，发现温度从28～30提高到33～34时，可防止产孢子能力的衰退。
④利用不易衰退的细胞传代：在放线菌和霉菌中，由于其菌丝细胞常含几个细胞核，甚至是由异核体组成的，因此若用菌丝接种就易出现离异（dissociation）或衰退；而孢子一般是单核的，用于接种，就不会发生这类现象。在实践上，若用灭过菌的棉团轻巧地对放线菌进行斜面移种，就可避免菌丝接入。另外，有些霉菌如用其分生孢子传代易于衰退，而改用其子囊孢子接种，则能避免退化。
⑤采用有效的菌种保藏方法：在用于工业生产的菌种中，重要的性状大多属于数量性状，而这类性状恰恰是最易衰退的。有些菌种如链霉素产生菌Streptomyce sgriseus（灰色链霉菌）的菌种保藏即使是采用干燥或冷冻干燥等较好的方法，还是会出现这类情况。这说明有必要研究和采用更为理想的菌种保藏方法。
二、工业生产菌种的复壮
生产上使用的菌种，在使用和保藏过程中，经常会逐渐向不利于生产的方向发生变化，这种变化称之为菌种衰退。由于菌种衰退包括菌种遗传特性的改变和菌种生理状况的改变这两个根本原因，衰退菌种的复壮也应该考虑这两个原因。一般衰退菌种的复壮措施如下。
1.纯种分离法（pure culture isolation）
在衰退菌种的细胞群中，一般还存在着仍保持原有典型性状的个体。通过纯种分离法，设法把这种细胞挑选出来即可达到复壮的效果。纯种分离方法极多，大体可分两类，一类较粗放，可达到“菌落纯”水平（fure culture in colony lever）；另一类较精细，可达到“菌株纯”的水平（fure culture in strain lever）。常用的方法有平板表面涂布法、平板划线分离法、琼脂培养基浇注法、用“分离小室”进行单细胞分离、用显微操纵器进行单细胞分离和用菌丝尖端切割法进行单细胞分离等。
2.淘汰已衰退的个体
芽孢产生菌经高温（80）处理15min，则不产芽孢的个体被淘汰。又如对“5406”抗生素产生菌的分生孢子，采用-10～-30的低温处理5～7d，使其死亡率达到80%，结果发现，在抗低温的存活个体中，留下了未衰退的健壮个体。
3.选择合适的培养条件
一般来说将保藏后的菌种接种在保藏前所用的同一培养基上，有利于菌种原有性状的恢复。但是应该看到，菌种经过多次传代培养或菌种保藏后，其生理状态可能发生较大的变化，特别是可能出现某些生长因子的缺乏。由于菌种分离培养基和菌种斜面培养基要求营养成分相对贫乏，在这样的培养基上连续传代很可能导致菌种群体的生理特性衰退。例如平菇菌种在PDA培养基（即土豆-葡萄糖培养基）上连续传代会导致菌种衰退，而在PDA综合培养基（PDA培养基中添加维生素和蛋白胨等）中培养则有使衰退菌种复壮的作用。又如赤霉素菌种也可在培养基中加入蜜糖、氨基酸、核苷酸等物质来使菌种复壮。
以上综合了一些在实践中曾收到一定成效的防止菌种衰退和达到复壮的某些经验。但应指出的是，在使用这些措施之前，还得仔细分析和判断一下自己的菌种究竟是发生了衰退，还是属于一般性的饰变或污染。
三、工业生产菌种的保藏
微生物是具有生命的，其世代周期一般很短，在传代过程中容易发生变异、污染甚至死亡，因此常常造成生产菌种的退化，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于保持优良菌种优良性状的稳定，满足生产的实际需要。
菌种保藏对于基础研究和实际应用都有非常重要的意义。在基础研究中，菌种保藏可保证研究结果获得良好的重复性。对于有经济价值的生产菌种，可靠的保藏条件可保证菌种的高产稳产。
菌种的保藏方法很多，其基本原理都是根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般可以通过降低培养基营养成分、低温、干燥和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。菌种保藏的方法很多，好的菌种保藏方法除了能长期保持菌种原有的优良性状不改变外，还应简便、经济，以便在生产上能广泛使用。
（一）工业生产菌种常用保藏方法
1.斜面保藏法和穿刺保藏法
（1）斜面保藏法 斜面保藏法是一种短期的保藏方法，广泛适用于细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等的短期保藏。将微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下培养并生长良好后，放入4～5冰箱中保藏，一般保存期为3～6个月，到期后须重新传种再行保藏。对不同的菌种，其保藏的温度和时间并非绝对相同。有个别菌种甚至在37保藏为宜，也有的需要1～2周传代一次。这种保藏方法的弊端在于短期内多次传代容易引起菌种发生变异，杂菌污染的机会也随之增多。采用这种方法保藏菌种时，可以在可能的范围内减少碳水化合物的含量，或者将试管口更好地密封，减少培养基失水和杂菌污染，以延长保藏期。
（2）穿刺保藏法 穿刺保藏法是斜面保藏法的一种改进，常用于各种好气性细菌的保藏。其方法是配置1%的软琼脂培养基，装入小试管或螺口小管内，高度1～2cm，121灭菌后，不制成斜面而使其凝固，用接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处。经培养后，微生物在穿刺处和培养基表面均可生长，然后覆盖2～3mm的无菌液体石蜡，放入冰箱中保藏，可保藏6～12个月。液体石蜡能够防止培养基失水并隔绝氧气，降低微生物的代谢作用，因此保藏效果比斜面要好。如果直接将液体石蜡加入生长好菌种的斜面上，也可以得到相似的效果。在保藏期间如果发现液体石蜡减少，应及时补充。这种方法的适用范围较广，也可用于放线菌和真菌的保藏。
穿刺保藏法和液体石蜡保藏法简便实用，但对不同的微生物种类保藏期有很大的差异。如有的真菌可保藏10年之久。对一些形成孢子能力很差的丝状真菌，液体石蜡保藏更有效。液体石蜡法不适用那些能够利用石蜡为碳源的微生物，如固氮菌、分枝杆菌、沙门氏菌、毛霉、根霉等。
2.沙土管干燥保藏法
这种保藏法适用于产生孢子的丝状真菌和放线菌，或形成芽孢的细菌。其原理是造成干燥和寡营养的保藏条件。它的制备方法是首先将沙和土分别洗净烘干并过筛（一般沙用80目过筛，土用100目过筛），按沙与土的比例为（1～2）：1混合均匀，分装于小试管中，分装高度约为1cm，121高压间歇灭菌2～3次，无菌实验合格后烘干备用。也有只用土或只用沙作载体进行保藏的。菌种可制成浓的菌或孢子悬液加入，放线菌和真菌也可直接刮下孢子与载体混匀。接种后干燥器抽真空并封口（熔封或石蜡封口），放在干燥器中在5冰箱内保藏。保藏期一般为两年，有的微生物可保藏10年之久。
除了用沙、土作为载体外，还可用硅胶、磁珠或多孔玻璃珠来代替。适于这些载体保藏的微生物不多，保存期亦较短，所以不及沙土更为实用。
3.真空冷冻干燥保藏法
由于这种菌种保藏方法的保藏期长、变异小、适用范围广，也是目前较理想的保藏方法，是各保藏机构广泛采用的主要保藏方法。例如，曾报道美国标准菌种保藏所（ATCC）保藏的6500多株菌种中，仅有不到100株无法用这个方法保藏。病原菌中98.5%可以用这一方法保藏。其原理是创造干燥和低温的保藏环境。基本方法是在较低的温度下快速将微生物细胞或孢子冻结，保持菌种的细胞完整，然后在减压情况下使水分升华，这样使细胞的生长代谢等生命活动处于停止状态，得以长期保藏。这种方法的基本操作程序如下。
①安瓿管的处理：安瓿管的内径一般为8～10mm，长度不小于100mm。先用毛细管加入洗涤液浸泡过夜，再用蒸馏水洗干净后烘干，瓶口加棉花塞好，并用纸包上，121灭菌30min，取出在60烘箱中干燥备用。
②保护剂：其作用是保持菌种细胞的生命状态，尽量减少冷冻干燥时对微生物引起的冻结损伤。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。保护剂可采用低分子和高分子化合物，如氨基酸、有机酸、糖类、蛋白质、多糖等。常用的有脱脂牛乳和血清。如马血清或马血清中加入7.5%的葡萄糖。保护剂用之前采用适当的方法灭菌。
③菌悬液制备：应该用最适的培养条件（如培养基、温度、培养时间等）培养菌种，以获得良好的培养物用于长期保藏。培养时间应掌握在生长后期，因为对数生长期的细胞对冷冻干燥的抵抗力较弱，产孢子的微生物需适当延长培养时间以期获得成熟的孢子。一般细菌培养24～48h，酵母72h。放线菌和丝状真菌7～10d以上。操作时，在无菌条件下先将少量保护剂加入斜面，轻轻刮下菌苔或孢子，制成菌悬液。用毛细滴管取0.1～0.2mL菌悬液加进灭好菌的安瓿管中，塞好棉花塞。
④冷冻干燥：冷冻温度达-15～-30即可。装入菌悬液的安瓿管应尽快冷冻，以防菌体沉淀为不均匀的菌悬液以及微生物再次生长或萌发孢子。达到冷冻温度后，立即启动真空泵，在15min内使真空度达到66.66Pa。真空度上升至13.33Pa以上，可以升高温度至20～30.此时由于升华还在继续，样品不会融化。干燥完毕后，关闭真空泵，排气，取出安瓿管在多孔管道上再抽真空并封口。
⑤安瓿管的保藏：安瓿管在4～5温度下可保藏5～10年，室温下保藏效果不佳。影响保藏效果的因素除菌种、菌龄外，还与样品中的含水量直接有关，通常含水量在1%～3%时保藏效果较好，5%～6%时保藏效果相应降低，含水量达到10%以上，样品就很难保藏。
4.液氮保藏法
液氮保藏法保藏菌种的效果好，方法简单，保藏对象也最为广泛。其方法是将浓的菌悬液加入无菌的保护剂中，如细菌以浓度为10%的甘油或5%的二甲亚砜（DNSO）作为防冻保护剂。每个安瓿管分装2～10mm菌悬液，立即封口。封口后要严格检查安瓿管，不能有裂纹，确保液氮不致渗入安瓿管，以免取用时安瓿管破裂。经过检验的安瓿管开始以每分钟降低1的速度冷却至-25左右，再放入液氮罐。有的菌种在放入液氮罐之前，须用干冰-乙二醇等制冷剂冷却至-78.安瓿管保藏在-150或-196的液氮中，保藏期一般为2～3年，长的可达9年之久。液氮每周的蒸发量大约为1/10，所以保藏期中要注意液氮的补充，使液氮液面保持在固定的水平。从液氮罐中取出安瓿管应当放入38～40的温水中振荡1～2min，使之完全融化，这样有利于细胞的复苏，ATCC的经验认为这样处理后再移种比自然融化的存活率要高。
5.悬液保藏法
悬液保藏法的基本原理是寡营养保藏，即将微生物悬浮在不含养分的溶液中，如蒸馏水、0.25mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）或生理盐水中保藏。此方法适用于丝状真菌、酵母状真菌及肠道科细菌，在10或室温（18～20）保藏比在低温保藏更好。大部分能保藏一年或更长。在保藏时掌握的关键是试管应密封好，以防水分蒸发。
6.低温保藏法
大多数微生物可在-20以下的低温中保藏。在密封性能好的螺口小管中，加入1～2mL菌液，封口后直接放入低温冰箱保藏即可。一般温度低时保藏效果好，如果低温冰箱发生温度变化，引起悬液融化，会影响保藏效果。应用浓度高的菌悬液为宜，但因微生物不同而异。该法的保藏期约在一年，某些菌可保藏长达10年。对容易死亡的无芽孢厌气菌特别适用，大多数能存活数年，对放线菌也很有效。此方法在实际应用中比冷冻干燥法更方便，但要注意低温冰箱的故障和停电事故，可以在低温槽内留有一定的空间，如果发生停电或故障可加入干冰以防止培养物的融化。融化后的菌种不能再用低温保存，要重新移种后再冷藏。
（二）菌种保藏的注意事项
菌种保藏要获得较好的效果，需注意如下三个方面。
1.菌种在保藏前所处的状态
绝大多数微生物的菌种均保藏其休眠体，如孢子或芽孢。保藏用的孢子或芽孢等要采用新鲜斜面上生长的丰满的培养物。菌种斜面的培养时间和培养温度影响其保藏质量。培养时间过短，保存时容易死亡；培养时间长，生产性能衰退。一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。
2.菌种保藏所用的基质
斜面低温保藏所用的培养基，碳源比例应少些，营养成分贫乏些较好，否则易产生酸，或使代谢活动增强，影响保藏时间。沙土管保藏需将沙和土充分洗净，以防其中含有过多的有机物，影响菌的代谢或经灭菌后产生一些有毒的物质。冷冻干燥所用的保护剂，有不少经过加热就会分解或变性的物质，如还原糖和脱脂乳，过度加热往往形成有毒物质，灭菌时应特别注意。
3.操作过程对细胞结构的损害
冷冻干燥时，冻结速度缓慢易导致细胞内形成较大的冰晶，对细胞结构造成机械损伤。真空干燥程度也将影响细胞结构，加入保护剂就是为了尽量减轻冷冻干燥所引起的对细胞结构的破坏。细胞结构的损伤不仅使菌种保藏的死亡率增加，而且容易导致菌种变异，造成菌种性能衰退。
四、国内外菌种保藏机构
菌种是一个国家的重要资源，世界各国都对菌种的保藏极为重视。在开展菌种保藏方法研究的同时，许多国家都建立了专门的菌种保藏机构，世界上现有700多家菌种保藏机构，其中国际知识产权组织承认的法定保藏机构仅有28家。如美国标准菌种保藏所（ATCC），保藏各类菌种10000株以上。美国农业部农业研究服务部（ARS）菌种保藏所收藏近20000株，主要是有关农产品加工所用的菌种，其中酵母近10000株。荷兰霉菌中心保藏所（CBS）保藏各种菌种达20000株，其中霉菌有10000株以上。还有英国国立标准菌种保藏所（NCTC）、日本大阪发酵研究所等。我国有中国科学院微生物研究所的普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）和武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。
系统的菌种保藏工作是19世纪末和20世纪初才开始的，最早为捷克学者Kral系统地收集菌种；1914年，Rogers首创冷冻干燥保藏法。1925年，美国成立国际著名的ATCC（Amer-ican Type Culture Collection），当时收藏有2000个不同的菌株；1960年，ATCC试用液氮法保藏菌种（liquid nitrogencryo-preservation），影响很大。我国于1952年在北京建立了第一个菌种保藏机构――菌种保藏委员会。
（一）我国主要的微生物菌种保藏机构
①普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）：
中科院微生物所，北京（AS），真菌、细菌
中科院武汉病毒研究所，武汉（AS-IV），病毒
②农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）：
中国农业科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）
③工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）：
中国食品发酵工业科学研究院，北京（IFFI）
④医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）：
中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID），真菌
卫生部药品生物制品检定所，北京（NICPBP），细菌
中国医学科学院病毒研究所，北京（IV），病毒
⑤抗生素菌种保藏管理中心（CACC）：
中国医学科学院抗生素研究所，北京（IA）
四川抗生素工业研究所，成都（SIA）
华北制药厂抗生素研究所，石家庄（IANP）
⑥兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）：
农业部兽医药品检察所，北京（CIVBP）
中国微生物菌种保藏管理委员会汇集了六个保藏管理中心及其所属专业实验室、菌种站保藏的部分微生物名录，编写出版《中国菌种目录》一书，其中包括病毒、噬菌体、细菌、放线菌、酵母菌和丝状真菌六部分。另外，我国还有许多从事微生物研究并保藏有一定数量各类专用微生物菌种的科研单位和大专院校。
（二）国外主要的微生物菌种保藏机构
①美国标准菌种收藏所（ATCC），American Type Culture Collection。Rockvill，Maryland，U。S。A
②美国冷泉港研究室（CSH），Cold Spring Harbor Laboratory U。S。A
③日本东京大学应用微生物研究所（IAM），Institute of Applied Microbiology。University of Tokyo，Japan
④日本大阪发酵研究所（IFO），Institute for Fermentation。Osaka，Japan
⑤日本东京科研化学有限公司（KCC），Kaken Chemical Company Ltd。Tokyo，Japan
⑥英国国立标准菌种收藏所（NCTC），National Collection of Type Culture。London United Kingdom
⑦美国国立卫生研究所（NIH），National institutes of Health。Bethesda，Maryland，U。S。A
⑧美国农业部北方开发利用研究部（NRRL），Northern Utilization Research and Development Division，U。S Development of Agriculture。Peoria，U。S。A
参考文献
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