周培源出生于江苏省宜兴县（今属江苏省无锡市）的一个书香之家。周培源的父亲周文伯自幼读书，中了秀才，后因父亲谢世，不得已当家立业，操持家政。他深受维新思想的影响，富于创新精神，先后在宜兴、南京、上海、汉口等地开办了各种实业。从耕读传家到兴办实业，这是一种历史性的变化，周文伯在宜兴近代史上，堪称开风气之先的人物。
周培源的母亲冯瑛出身于邻乡夏芳扶风桥妇科名医世家，端淑娴雅，慈爱谦和，为族人所称道。她生育了8个子女，但只有4个长大成人。周培源排行第二，上有姐姐巧红，下有妹妹保红和海红。
身为独生子，又是两代单传，千亩地一棵苗，在这个富裕之家，周培源深受疼爱并承托着很高的期望。顽皮来自天性，也来自宽松的家庭环境。3岁时，他便为“主持正义”挺身而出，竟拿一根擀面杖向父亲冲去，要与爱摆家长威风的父亲抗争。这场“风波”，使周文伯醒悟，认识到应对儿子严加管教，于是三岁半时，他便送周培源进本村的私塾去读书。但毕竟年龄太小，日常生活还不能自理，父亲便让姐姐陪读。
周培源在私塾开蒙之后，曾先后在宜兴、南京、上海、杭州等地就读过多所学校。其间，转学频繁，常常不尽如人意，只有上海万竹小组而正规而优质的教育，使他对学习产生了浓厚的兴趣。在十五六岁时，他考取了上海圣约翰大学附中。这是一所美国人办的教会学校，设施现代、学费昂贵、教学水平很高。入学一年多，五四运动在北京爆发了，很快波及到上海，圣约翰大学附中的学生也群起响应。周培源为五四爱国精神所感染，投身学生运动，上街游行、贴标语、喊口号，并与学校当局的玩弄权术、挑拨离间伎俩展开了坚决的斗争，因而被学校开除。
周培源失学后，返回宜兴老家，在离家五里地的潮音寺静心攻读。后来，他在报上看到清华大学在江苏招收插班生的广告，赶赴南京应试，一箭中的，成绩名列第二。然而，录取的名单中没有他，李代桃僵，他的位置被人顶替了。他又一次赶赴南京，找有关部门反复交涉，清华学校给江苏增添了一个名额，他终于争得了应得的权利。
1919年，他考入清华学校（今清华大学前身）中等科。学习期间，他对数学产生了浓厚的兴趣，并发表了论文《三等分角法二则》，受到当时数学教授郑之蕃的赞许。
1924年，他由清华学校高等科毕业。同年秋天，由于成绩优秀，他被清华学校派送去美国继续完成大学课程，入美国芝加哥大学数理系二年级学习。周培源于1926年春、夏两季分别获学士和硕士学位。
1927年，周培源入美国加利福尼亚理工学院继续攻读研究生。他先从师贝德曼，后改从E.T.贝尔做相对论方面的研究，次年获理学博士学位，并获得最高荣誉奖。
1928年秋，他赴德国莱比锡大学，在W.K.海森伯（Heisenberg）教授领导下工作。
1929年，又赴瑞士苏黎世高等工业学校，在S.泡利（Pauli）教授领导下从事量子力学研究。同年回国，被聘为国立清华大学物理系教授，年仅27岁。
1932年，周培源与王蒂澂女士结婚，生有四个女儿。王蒂澂退休前，一直在清华大学附属中学教书。
1936年至1937年，根据清华大学休假规定，周培源再赴美国，在普林斯顿高等学术研究院从事理论物理的研究。其间他参加了A.爱因斯坦（Einstein）教授亲自领导的广义相对论讨论班，并从事相对论引力论和宇宙论的研究。
第二次世界大战开始后，美国国内急需科技人员，周培源一家刚入境，就收到移民局的正式邀请，给予全家永久居留权，周培源对此一笑了之。
1937年，他假满回国。不久，抗日战争爆发。7月底，平津沦陷；8月，侵华日军开进了清华园。周培源受校长梅贻琦之托，安排学校南迁，曾先后任长沙临时大学和昆明西南联合大学物理系教授。在这期间，他抱着科学家应为反战服务，以科学拯救祖国危亡的志向，毅然转向流体力学方面的研究。
1943年至1946年，周培源再次利用休假赴美国。他先在加利福尼亚理工学院从事湍流理论研究，随后参加美国国防委员会战时科学研究与发展局海军军工试验站从事鱼雷空投入水的战事科学研究。
1945年末，第二次世界大战结束，鱼雷空投入水研究组的大部分人员被美国海军部留用，成立海军军工试验站，周培源也被应邀留下。由于该试验站是美国政府的研究机构，应聘人员要有美国国籍。当时，周培源明确提出：不做美国公民，只担任临时性职务；次年即离美代表中国学术团体去欧洲参加国际会议。在美国有关方面接受了上述这些条件后，他在美国继续工作不到一年，于1946年7月离职去欧洲参加牛顿诞生300周年纪念会和国际科学联合会理事会，还参加了在法国召开的第六届国际应用力学大会，并被这次大会以及会后新成立的国际理论与应用力学联合会选为理事。
1946年10月，周培源由欧洲重返美国，并于1947年2月与夫人携三个女儿全家返回上海。1947年4月回到北平，继续在清华大学担任教授。
中华人民共和国成立后，周培源曾任清华大学教务长、校务委员会副主任，北京大学教务长、副校长和校长，中国科学院副院长，中国科协主席、名誉主席，世界科协副主席，中国国际科技促进会会长，中国力学学会副理事长、名誉理事长，中国物理学会理事长、名誉理事长，欧美同学会名誉会长，中国人民外交学会副会长，中国人民争取和平与裁军协会会长，九三学社主席，第一、二、三、四届人大代表，第五届人大常委，第三、四届政协常委，第五、六、七届政协副主席。1980年获美国普林斯顿大学名誉法学博士学位，1980年和1985年两次获得美国加利福尼亚理工学院“具有卓越贡献的校友”奖。1981年因年事已高，周培源主动辞去了校长职务。