美国和英国的制药公司都不愿意使用发酵的方法（用微生物在合适的培养基中令其生长并产生新的物质，这种方法通常称为发酵）来生产青霉素，因为需要很大的设备，占很大的面积，产量也不高。他们根据维生素类用化学合成方法比从天然物中提取分离要便宜得多的经验，打算用化学合成方法生产青霉素。要合成青霉素首先必须知道它的化学结构，于是人们开展了对青霉素化学结构的研究。
青霉素化学结构的研究工作由英国的鲁宾逊和亚当斯负责领导，他们两人在当时均可称为有机化学大师。研究中，英国的青霉素化学委员会和美国的医学研究委员会也交换信息，但是有关青霉素的化学性质等问题仍属军事机密。
首先出现的问题是青霉素的纯度只有50％，大量杂质会影响结构的测定。1943年夏天，美国的施贵宝公司发现可以用重结晶法精制。第二个出现的问题，是英国得到的青霉素纯品与美国得到的不同。由此才认识到，青霉菌品种的不同产生的青霉素各种衍生物的比例也不同。进一步研究又发现，已经认为是纯品的青霉素其实仍然是混合物，需要进一步分离提纯。
青霉素的化学结构，经过两国有机化学家的研究，到1943年底认为有两种最可能的结构：一种是一个噁唑酮环通过一个碳原子与一个氢化噻唑环相连，另一种是一个四元的β-内酰胺环通过两个原子与氢化噻唑环并合。当时是使用化学降解方法测定化学结构。由于青霉素的化学性质很不稳定，结构很容易发生变化，因此哪个结构是正确的，难于分辨。
到1945年，由X光结晶学的研究证明青霉素的结构为结构2，是一个含有四元β-内酰胺环的化合物。四元环的环张力大，与五元的氢化噻唑环并合更增加了不稳定性，很容易开环而失去抗菌作用。在酸、碱性介质中更易水解开环。结构1就是结构2的水解重排产物。在确定了青霉素主核的化学结构后，侧链的结构就容易确定了。由此证明，英国分离出的纯青霉素为苄基青霉素，后定名为青霉素G；美国分离出的纯青霉素为2-戊烯酰基青霉素，后定名为青霉素F。另外又分离出5种青霉素，都是侧链不同的结构，分别定名为V、O、S、X和K。这7种青霉素是青霉菌发酵过程中产生的主要成分，其中以青霉素G的抗菌作用最强。为了获得主要为青霉素G的产品，发现在发酵中加入苯乙酸或苯乙酰胺即可得到青霉素G占绝对多数的产品。我们把加入的苯乙酸或苯乙酰胺称作“前体”。
在了解到青霉素的化学结构和其不稳定性后，各制药公司便都放弃了化学合成的想法，继续用发酵方法生产青霉素。到1957年，美国麻省理工学院的希汉教授终于实现了用化学合成方法合成青霉素V。但由于反应步骤多，反应条件苛刻，且收率只有1％，则其成本根本无法与发酵法相抗衡，以后虽没能用于青霉素的生产，但在学术上是有很高价值的。
青霉素G（我国现称青霉素钠，因为药用的是钠盐）在应用过程中逐渐暴露出它的缺点：即作用时间短，每天要注射三四次，很不方便；很不稳定，且只能注射不能口服，因为口服后会被胃酸破坏失效；抗菌谱窄，只对革兰氏阳性细菌有效，对革兰氏阴性细菌无效；细菌容易产生耐药性，需逐渐增大剂量；少数病人对青霉素具有过敏性反应，有的反应相当严重，可产生休克甚至死亡。后来为了避免过敏性反应，在使用青霉素之前先在手腕内侧的皮内注射很少量的青霉素，如果不发生红肿现象就可以使用青霉素治疗，如果有些红肿则表示对青霉素过敏，不能使用。由于青霉素的这些缺点，使一度被冷落的磺胺类药物又一次被重视；但磺胺类药物的好景不长，在发现半合成青霉素可以克服青霉素的一些缺点以后，磺胺类药物的重要性再一次下降。
所谓半合成青霉素就是将用发酵方法得到的青霉素侧链，用化学方法或酶水解法除去，再用化学方法带上其他的侧链。半合成青霉素得以实现，取决于6-氨基青霉烷酸的获得。
钱恩想，几种不同侧链青霉素的抗菌作用有明显的差别，特别是青霉素V对酸具有稳定性，说明青霉素的侧链对抗菌作用和青霉素的性质是有影响的。于是他的研究组就在发酵液中加入各种“前体”，希望得到侧链不同的青霉素。1958年，他们得到一种抗菌作用很弱的结晶物质，但它比青霉素G要稳定。经过证明，这个物质是6-乙酰氨基青霉烷酸。他们把乙酰降解，就得到6-氨基青霉烷酸。这样就可以用它作为原料，合成带各种侧链的青霉素了。
从1958年起，各大制药公司开始用6-氨基青霉烷酸进行半合成青霉素的研究。一时间出现了几千种半合成青霉素，其中发现了许多比青霉素G更好的抗生素。有的抗菌作用加强了；有的不仅作用加强而且对酸稳定，可以口服，减少了用药的麻烦；有的是更具有耐β-内酰胺酶的作用，对耐药的细菌仍然有效；有的不仅对G＋细菌有效，对G-细菌也有效，称为广谱抗生素。半合成青霉素使青霉素的研究和应用发展到一个新的阶段，为临床上提供了许多作用优良的抗生素。但是过敏性反应的问题始终没能解决，对青霉素G过敏的病人，对这些半合成青霉素同样过敏，也就是它们之间有交叉过敏性反应。
1958年后，研究者们又发现大肠杆菌可以产生一种酰胺酶，专门可以把青霉素G的苯乙酰基水解，得到6-氨基青霉烷酸。这就为发展半合成青霉素创造了条件。