一、抗HIV药物概述
艾滋病的学名为获得性免疫缺陷综合征（AIDS），是1981年美国首先发现的一种由病毒引起的致死性传染病，其病原为人类免疫缺陷病毒（HIV）。艾滋病在这些年来是科研热点中的热点。
HIV属于逆转录病毒科的慢病毒亚科，直径约为100nm左右，整个病毒由四部分（由外到内）组成：①两层脂质外膜；②一层糖蛋白（GP41和GP120）；③两层蛋白质内膜（P24和P18）；④病毒RNA和几个逆转录酶。核酸为单股正链RNA，它既可以作为逆转录成cDNA的模板，又可直接作为mRNA翻译出病毒蛋白。
针对HIV复制周期的不同阶段，治疗HIV感染的可能途径有：①针对HIV毒粒：可溶性CD（下标4）、中和抗体；②针对病毒进入：CD（下标4）类似物、半乳糖神经酰胺类似物、中和抗体、唾液糖蛋白、硫酸酯化多糖、T肽段；③整合前的早期阶段：逆转录酶抑制剂、核苷类似物、非核苷类抑制剂、整合酶抑制剂、IFN、反义核糖核酸；④整合后：抗Tat（RO24－7429）、白酶抑制剂（PI）、反义核苷酸、肝素、核酶、细胞内抗病毒因子；⑤细胞出芽：糖基化抑制剂、IFN；⑥抗感染细胞：天花粉蛋白、抗病毒抗体依赖性细胞毒、重组CD（下标4）毒素、gp120毒素、CD（下标8上标＋）细胞。
抗艾滋病药物可分为5类。
（1）抑制HIV逆转录酶活性的逆转录酶抑制剂，其中包含核苷类逆转录酶抑制剂13种、非核苷类逆转录酶抑制剂4种。
（2）抑制病毒蛋白质水解的蛋白酶抑制剂11种。
（3）组织病毒与宿主细胞膜融合的融合抑制剂1种。
（4）组织病毒进入细胞的CCR5辅助受体拮抗剂，称为侵入抑制剂1种。
（5）抑制病毒整合酶链转移活性的整合酶抑制剂1种。
（一）逆转录酶抑制剂
HIV是逆转录病毒，其复制过程依赖一种独特的酶——逆转录酶将病毒RNA逆转录为DNA前病毒。所以逆转录酶抑制剂能有效抑制病毒复制，是临床上最早应用的抗艾滋病药物，可分为核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）和非棱苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）两类。
（1）NRTIs属于这一类的药物主要有6个品种，即齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定和阿巴卡韦，其中齐多夫定是第1个上市的抗艾滋病药，也是治疗艾滋病的首选药。阿巴卡韦在1998年批准上市，其优点是口服生物利用度好，可进入中枢神经系统；耐药性发展慢和患者耐受性佳，但3％的患者有过敏反应，应高度警惕。
（2）NNRTIs多年来这一研究已有喜人成果，先后筛选出一系列结构各异的NNRTIs。如：四氢咪唑苯并二氮杂酮（TIBO）类似物及与之结构相近的二吡啶并二氮杂酮类似物、二芳香杂环呱嗪（BHAP）类似物、吡啶酮类似物、HEPT及TSAO类似物等等。这些NNRTIs经临床使用验证，疗效指数较高，无毒副作用，具有较大的安全性，只是有些药物的有关耐药性问题还有待突破。
（二）蛋白酶抑制剂（PI）
cDNA在整合酶的作用下，与宿主细胞的染色体整合，经一系列的复杂过程，制造出病毒前体蛋白，再由蛋白酶切割，然后进一步完善病毒结构，使之形成有功能的完整病毒。蛋白酶抑制剂可阻止前体蛋白的裂解，导致无感染病毒颗粒的堆积，达到抗病毒的效果，从而抑制病毒的复制。这类药物主要有沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦及安普那韦及洛匹那韦等6个品种。此类药物也会引起一些不良反应，如腹泻、转氨酶升高、血脂增高等。另外，用药不当会产生交叉耐药。
（三）融合抑制剂
这类药物主要有葡萄糖苷酰鞘氨醇合成酶抑制剂PPMP、小分子化合物TAK－779、Cyanovirin N（CV－N）、二磺基萘的衍生物FP21399、Siamycin类似物SPC3及betμlinic酸衍生物RPR103611。由36个氨基酸组成的小分子肽pentafuside（T20）和AMD3100现已进入Ⅱ期临床实验。因此，设计合成小分子化合物，从中筛选出抑制HIV与宿主细胞结合的药物，是抗HIV药物研究很活跃的领域之一。
（四）整合酶抑制剂
化合物L－731988和L－708906的有效抑制整合酶浓度的IC（下标50）分别为80μmol／L和50μmol／L，是目前报道的最有潜力的整合酶抑制剂。
（五）生物制剂
随着人们对艾滋病发病机制日趋深入研究，免疫治疗、免疫重建的认识加强，生物制剂的研究和利用逐步增多。IL－2、IL－10、IL－16、TNF－α和IFN等细胞因子被广泛应用于艾滋病治疗。
（六）HIV疫苗
HIV疫苗的研究也取得一定进展。HIV疫苗包括灭活疫苗、活的感染性疫苗、病毒活疫苗、重组亚单位疫苗、肽疫苗、病毒样颗粒、DNA疫苗。目前灭活疫苗仅用于治疗性实验，活的感染性载体疫苗部分正进行Ⅰ期临床实验，重组亚单位疫苗如rgp120、rgp160等正进行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ临床实验，少数肽和脂多肽疫苗以及一些病毒颗粒假病毒体疫苗也处于临床前实验阶段。控制艾滋病的最好方法就是开发有效的预防性疫苗。研究表明，艾滋病病毒感染能够预防或通过接种得以控制，但保护性抗HIV疫苗必须满足：①候选疫苗必须安全；②能诱导抗原初分离物的持续交叉中和抗体，有效抗clade内和clade间的变异；④诱导持续性CTL反应，诱导CD（下标8）细胞因子；④诱导黏膜免疫；⑤有区别疫苗与被感染物的标记物。目前已经开发出的疫苗主要有ALVAC－HIV疫苗、gp120疫苗、DNA－HIV疫苗和HIV活疫苗等。
（七）中药
国内很早就开始采用中药治疗艾滋病的研究并取得了一定的成果，如发现香菇多糖、丹参、黄芪和甘草甜素等有调整免疫功能的作用。在美国，科学家对常用的中药也进行了各个方面的研究，发现有些中药能直接杀死HIV，有些中药能间接地增强巨噬细胞吞噬能力，并能促进抗体的生成。①增强巨噬细胞吞噬能力的中药有：人参、西洋参、太子参、黄芪、白术、灵芝、茯苓、当归等；②促进抗体生成、提高淋巴细胞转化作用的中药有：肉桂、附子、仙灵脾、锁阳、菟丝子等；③延长抗体活性的中药有：麦冬、玄参、沙参、鳖甲、鸡血藤、阿胶、女贞子等；④抗HIV中药有：猪苓、夏枯草、生甘草、七叶莲、甲基黄、猫爪草、土大黄等。中药毒副作用相对较小，价格低廉，有较好的临床应用前景。
二、抗HIV药物主要药效学研究
艾滋病病毒对人有感染性，细胞培养和动物实验不能在一般实验室中进行，必须在P3实验室中进行。
（一）细胞水平筛选检测抗HIV药物筛选方法
病毒：艾滋病病毒1型HIV－1标准株，Ⅲ－B株，对AZT敏感和耐药株及临床分离病毒株。
细胞：人T淋巴细胞传代株C－8166，HUT78，MT－2等。
阳性对照药物：叠氮脱氧胸苷（AZT）。
1．病毒滴度（TCID（下标50））的测定
在进行抗病毒活性检测前首先要确定所用病毒的滴度，以便在实验中选取合适的感染复数（multiplicity of infection，MOI）进行实验。
具体方法：在96孔细胞培养板第一列的6个孔中加入133μlRPMI－1640完全培养液，在2～10列每孔加入150μl RPMI－1640完全培养液；室温溶解病毒上清并立即加67μl至第1列的每孔中，成为1：3稀释的上清；混匀后每孔吸50μl到第2列的6个孔，依此类推，继续做每一列的4倍稀释，至第10列的6个孔，每扎丢弃50μl。从选4×10（上标5）个／ml处于对数生长期的C8166细胞装在无菌器皿中，按50μl／孔加入C8166细胞悬液，每孔终体积200μl。放置于37℃、5％CO（下标2）培养箱孵育。每天观察细胞病变效应（CPE）的形成（即合胞体形成），从高浓度至低浓度进行观察。第4天从低浓度至高浓度加入100μl RPMI－1640完全培养液。培养两周直到CPE不再形成。对每个病毒稀释度的CPE形成的孔数计数。用Reed和Muench方法计算TCID（下标50）。注意：病毒稀释时每一步要彻底混匀；加细胞时从低浓度向高浓度加。
2．初筛实验
（1）化合物对宿主细胞的毒性为评价抗HIV－1化合物的细胞毒性和抗病毒活性，一般需要选用病毒的宿主细胞测定化合物的体外细胞毒性作用。常用细胞有：人T淋巴细胞系细胞C8166、正常人外周血单个核细胞（PBMC）和HIV－1慢性感染人T淋巴细胞系细胞H9（HIV－1IIB／H9）。常采用的方法有：台盼蓝染色法，通过直接计数计算细胞存活率；MTT／XTT检测法。
（2）化合物对HIV感染细胞的保护作用
①原理：HIV体外感染某些细胞系（如C－8166、MT－2、MT－4等）后，在一定的时间内（5～7天），HIV感染细胞会死亡。用MTT或XIT方法测定存活细胞，以ELISA仪测定OD值。该方法也同时测定了化合物对正常未感染细胞的细胞毒性。计算出EC（下标50）。（保护50％HIV感染细胞存活的浓度）、EC（下标90）（保护90％HIV感染细胞存活的浓度）、CC（下标50）（体外对50％宿主细胞产生毒性作用的浓度）和治疗指数（TI，CC（下标50）／EC（下标50）比值）。该方法适用于大批量样品的筛选，但对作用于HIV复制周期某些靶点（如结合和融合、糖基化等）的化合物不敏感。
②方法：在96孔细胞培养板上对每种化合物进行5倍倍比稀释，每个稀释度设6孔，共6个稀释度，每孔100μl。同时设置不含化合物的未感染或感染病毒的细胞对照组和阳性药组。每个稀释度中的3孔分别滴加8×10（上标5）个／ml的细胞悬液和病毒上清各50μl，另3孔滴加4×10（上标5）个／ml的细胞悬液100μl，每孔终体积为200μl。置37℃、5％CO（下标2）培养箱孵育。感染后第3天补加100μl新鲜培养基。第5天每孔加入20μlMTT，4b后加DMSO溶解甲臜，酶标仪测定OD（下标595）／OD（下标630）值。计算化合物对细胞生长的抑制率，对病毒感染细胞的保护率、CC（下标50）和EC（下标50）。
③注意事项：选择HIV感染和溶解效应敏感的细胞系很重要。C8166是携带HTLV－1病毒的人T淋巴细胞系细胞，是首选细胞。HIV感染该细胞后产生大的合胞体细胞和膨胀化效应，4～6天内导致细胞死亡。MT－1细胞也是常用细胞系，受HIV感染后产生溶解效应，不是细胞病变效应。其他T淋巴细胞系细胞如H9、JM、CEM和U937，在该实验中不敏感，HIV感染后往往形成慢性感染。
虽然C8166对大多数HIV－1株、HIV－2和SIV都敏感，但通常用HIV－1ⅢB或HIV－1 MN作为初筛病毒株。
低MOI的HIV感染细胞，病毒呈现较少复制周期，使抑制病毒复制晚期的化合物能显示出抗病毒活性。
（3）化合物对HIV诱导宿主细胞形成合胞体的抑制实验
①原理：合适MOI的游离HIV－1颗粒感染C8166细胞3～4天后，HIV感染细胞会融合形成合胞体细胞。在显微镜下观察和计数含有不同稀释浓度的化合物和不含待测化合物培养孔中的合胞体细胞数。计算出抑制率和EC（下标50）。
②方法：初筛实验可选用HIV－1ⅢB感染C8166细胞，将8×10（上标5）个／ml C816650μl／孔接种到含有100μl／孔梯度倍比稀释化合物的96孔细胞培养板上，然后加入50μl的HIV－1ⅢB稀释上清。设三个重复孔，同时设置不含化合物的正常细胞对照孔。置37℃、5％CO（下标2）培养箱孵育3天，在倒置显微镜下（100×）计数HIV－1诱导细胞形成合胞体的数量，观察化合物抗HIV－1作用。EC（下标50）为抑制50％合胞体形成时的化合物浓度。
3．确证实验
（1）HIV抗原表达水平的测定（P24，gP120）
①原理：p24是HIV－1的衣壳蛋白。通过测定含有不同稀释浓度的化合物和不含待测化合物培养孔中上清的HIV－1 p24抗原含量，是判断化合物的抗HIV活性重要指标之一。
②方法：用ELISA双抗体夹心法。微孔板中包被p24单克隆抗体，加入含有不同稀释浓度的化合物和不含待测化合物的培养孔中上清及试剂盒中的阴性／阳性对照。以辣根过氧化镁（HRP）标记抗HIV抗体，标记的抗体与抗原抗体复合物结合，以四甲基联苯胺（TMB）和过氧化物酶作为底物，最后用酸中止反应。如果有强的颜色产生，则提示培养上清中存在HIV抗原。
（2）逆转录酶活性检测
①原理：在链亲和素标记的96孔板上加入病毒裂解液（含RT）和分别用地高辛和生物素标记的核苷酸，在病毒RT作用下合成一条标记的寡核苷酸链，再加入过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，经过显色反应判断病毒RT的活性。
⑦方法：取病毒感染3天的培养上清离心，用PEG8000沉淀浓缩病毒颗粒，4℃冰箱中静置16h，4℃、8000g离心10min弃上清，吸去残留的PEG溶液，裂解病毒。按RT试剂盒将模板／引物混合物加到反应管中，37℃孵育15h，再将反应产物加入链霉素包埋的微孔板中，37℃孵育1．5h，洗涤。加入抗地高辛－过氧化物酶标记二抗，37℃孵育1．5h。最后用ABTS底物显色，读取OD（下标405）／OD（下标490）值，并计算培养上清中病毒颗粒的RT活性。
（3）HIV感染阳性细胞的检测，IFA和FACS感染性病毒滴定间接荧光染色检测（IFA）HIV感染阳性细胞是一种相当有用和灵敏的确证实验，特别是在培养上清抗原水平很低时。
方法：细胞存活测定后，从96孔板中收集细胞，丙酮固定，先后与人抗HIV血清和FITC结合的羊抗人IgG反应，然后用荧光显微镜观察和计数IFA阳性细胞。计算出阳性细胞百分率和化合物对HIV抗原阳性细胞的抑制率。
（4）感染性病毒颗粒滴定方法：吸取5～10μl培养上清，滴加到96孔板第1列100μl的培养基中，然后2倍倍比梯度稀释，最后加入一定浓度的C8166细胞悬液。培养6～7天后，观察合胞体形成数和用XTT方法进行测定，与未处理感染细胞培养上清比较。
4．机制研究
（1）HIV－1慢性感染细胞与正常细胞间融合的阻断实验