恒温：由超级恒温水浴锅供给恒温加热管和灌流槽夹层37℃恒温水，以保持灌流液温度恒定。可在灌流液出口处连接一根带有侧管的玻璃管，插入温度计监测灌流液的温度。
（2）灌流液
①灌流液的配制：为使离体心脏处于成活状态并能正常工作，灌流液需供给其适当的氧、营养物质和其他底物。现一般用改良的Krebs－Henseleit缓冲溶液，其组成如下（mmol／L）：NaCl 118．0，KCl 4．7，MgSO（下标4）1．2，KH（下标2）PO（下标3）1．2，NaHCO（下标3）25．0，CaCl（下标2）2．5，葡萄糖11．0，pH7．4。加入EDTA－2Na（0．5 mmol／L）以螯合存在于试剂中的重金属。加入胰岛素（10μg／L）可加强心肌对葡萄糖的利用。加入甘露醇（16．0mmol／L）以维持一定的胶体渗透压。丙酮酸钠（2．27 mmol／L）作为另一种能量底物可保持心脏更稳定的功能期。同时，可根据实验要求加入一定浓度的其他底物、药物等。
②灌流液的平衡：灌流前，灌流液中通入气体平衡10min，富氧灌流液以95％O（下标2）十5％CO（下标2）混合气体平衡，调节气量使流入心脏灌流液氧分压维持在80kPa以上。缺氧灌流液以95％N（下标2）＋5％CO（下标2）混合气体平衡。也可根据实验要求选择其他混合气体。在灌流过程中持续通入平衡气体以维持灌流液气体分压。调节恒温装置，使灌流液在动物心脏的温度维持在37℃。配气系统可接N（下标2）、O（下标2）、CO（下标2）钢瓶，配制出所需比例的混合气体。
③灌流液系统的作用：逆灌系统，用于最初主动脉逆行灌流心脏，排出主动脉输出的液体，调节后负荷，测定主动脉压；顺灌系统，用于经左心房灌流心脏，灌流液从4个贮液器经换液器进入左心房；保温系统，由灌流液的加温装置及放置心脏的灌流槽组成，给离体戳心脏提供一个恒温环境。
【操作过程】
（1）称重后，腹腔注射乌拉坦1ml／100g。
（2）固定后，舌下静脉注入肝素0．3ml／100g。
（3）迅速开胸，除去胸腺，分离主动脉，在右心室肺动脉根部剪一切口，立即于主动脉根部上方0．5cm处做一半圆形切口并迅速插入主动脉导管，使心脏连结于灌流装置上，结扎固定好后开始逆行灌流。
（4）将肺以及心脏周围的血管及结缔组织除去，使心脏离体。
（5）用16号针头在左心室尖部扎一小孔，用以排出由静脉回流至心室的液体。
（6）在左心耳中间剪一小口，从该口处将充水的、头部带一薄壁乳胶小球的塑料导管经二尖瓣插入左心室，并于左心耳处结扎固定。
（7）在仪器的监测下，向球囊内注入生理氯化钠溶液，使左室的舒张末期压调整在0～10mmHg之间。
（8）用量筒定时收集1min内由蠕动泵排出的冠脉流出液作为冠脉流量。
【结果评价】
（1）生理记录仪在左心尖夹一个蛙心夹，通过肌力换能器输入生理记录仪，记录心肌收缩力的变化。
（2）离体心脏心电图将3个Ag（上标＋）／AgCl电极分别置于心脏心尖部和左右两侧，形成Einthvoven三角，连接多道生物信号记录仪，记录离体心脏心电图。
（3）心律失常检测评分标准：无心律失常为0分，房早或室早为1分，室上速或成对室性早搏或T波电交替为2分，室早呈三联率或呈短阵≥3个但≤10个为3分，持续室速（室早≥10个）或多行性室速或尖端扭转性室速为4分。
（4）冠状动脉灌流量的检测冠脉流量（ml／min）以单位时间内心脏流出的灌注液量计算。
（5）心内压的测量通过左心房插入尖端带有水囊或气囊导管到左心室，用于测量左室内压等指标。
【方法要点】
（1）麻醉剂量不能过量，过量后会影响心功能，过少实验过程中可以追加。
（2）制作离体心脏标本时操作要迅速，不要损伤心脏，保留较长的主动脉，方便稳固结扎；左耳剪口不能过大避免漏液。
（3）缓慢打开气瓶，以灌流管中约每10cm，出现一个气泡的气流速度对溶液充氧，心脏挂起前一定要排气泡。灌流压力和灌流液温度要严格维持恒定。
（4）冠状血管要保持通畅，避免凝血块堵塞血管。
附：hERG通道的膜片钳技术
一、实验用细胞的培养
（一）HEK－293细胞的传代培养
HEK－293细胞的复苏、分散、传代和冻存（略）。
（二）心肌细胞的分离与培养
目前，人们已经能够根据需要，利用豚鼠、大鼠、兔乃至人成功地分离出各种单个心肌细胞以用于电生理的研究。分离心肌细胞虽无统一的方法但无论大鼠或豚鼠以及其他动物，尽管其心肌细胞分离的细节有所差别，但分离的方法大致相同。
1．分离细胞的一般步骤
（1）冲洗心脏组织灌流整个心脏或心脏的一些组织碎片，常用无钙液冲洗。洗掉组织残存血液，并解除心肌细胞间的桥粒和连接。
（2）酶解消化分离根据所用动物选用不同浓度的可能含有多种酶成分的无钙液去溶解细胞外基质，同时为防止酶消化过度而导致细胞损伤，常加入纯化的牛血清白蛋白来保护心肌细胞，并且掌握酶消化的时间。
（3）温孵、机械振动用酶和去钙的方法可使细胞间的连接松散，部分细胞分离，机械振动使细胞完全分离，常用磁力搅拌器在温孵的条件下搅拌。
（4）清洗和保存细胞基本分离后，尽快终止酶的消化，冲洗残酶，低速离心，用不含酶的培养液悬浮细胞，可保存于含牛血清白蛋白的保存液中。
2．试剂配制
（1）0．1mg／ml多聚赖氨酸取多聚赖氨酸25mg，用双蒸水溶解并稀释至250ml，浓度为0．1mg／ml，用0．22μm的微孔滤膜过滤，4℃保存备用。
（2）解剖液葡萄糖2．95g，蔗糖7．53g，HEPES 3．57g，NaCl 8．05g，Na（下标2）HPO（下标4）·12H（下标2）O 6．45g，NaH（下标2）PO（下标4）·2H（下标2）O 19．5g，KCl 0．373g溶到1000ml双蒸水中。NaOH／HCl调pH 7．3，用0．22μm的微孔滤膜过滤，4℃保存备用。
（3）培养皿涂胶在无菌条件下取35mm塑料培养皿，涂多聚赖氨酸2次，超净工作台2h吹干备用。
3．注意事项
（1）灌注液成分或灌流液成分配方改变可以明显影响分离细胞的成活率，在改变成分时应注意整个溶液的渗透压的稳定，无钙液可稍偏酸性。
（2）心肌细胞分离技术最主要的工具是酶，不同种属的动物应选择适合的分离酶。酶的浓度切忌太高，浓度低可延长酶作用时间。此外，两种以上的酶按一定比例混合有时可产生较好的效果。
（3）Ca（上标2＋）浓度对心肌细胞分离过程的每一步都有重要的影响，适当的钙浓度对心肌细胞和酶的活性都是必需的，但在分离的细胞贮存液中应复钙，以保证细胞的正常生理功能。
（4）分离细胞的存储可以用KB液，也可用三抗溶液或者MEM营养液。
（5）心脏的移取速度，氧气的供应，温度的保持，溶液的pH以及整个实验操作的熟练程度等诸多因素都会影响实验成败。
二、全细胞记录的准备
（1）玻璃微电极制备常用于膜片钳记录的玻璃微电极有两种，一种是软质的苏打玻璃电极，适用于全细胞记录，另一种是硬质的硼硅酸盐玻璃电极，因其噪声小，更适用于单通道记录。与微电极质量相关的因素很多，总的来说，充满电极液后，电极电导适宜，浮游电容小，噪声小，头部呈子弹头形，尖端光滑的电极是好电极。两次拉制可使微电极头部呈子弹头形，涂硅酮树脂能降低浮游电容，热抛光使电极尖端光滑，更容易与细胞膜形成10Ω的高阻封接。
取外径12mm，壁厚2mm的软质中性玻璃长管，清洗干净晾干后用拉制仪拉制成外径1．4mm的无芯玻璃电极毛坯，临用前用微电极拉制仪二步拉制（参考参数：01 HEAT＝833，PULL＝63，STEP＝10，02 PULL＝1，TIME＝19，03 PULL＝168，TIME＝25）成尖端开口1～3μm的微电极，必要时涂硅酮树脂或经抛光仪抛光处理，充满电极内液时玻璃微电极的电极电阻约2～5MΩ。为得到相对一致的玻璃微电极，实验中所用玻璃微电极均来自同一批玻璃毛坯。
（2）电生理记录液的配制全细胞记录所用的记录液主要是电极内液和细胞外液。记录hERG电流，电极内液为（mmol／L）：NaCl 150，KCl 4，MgCl（下标2）1，CaCl（下标2）1．8，HEPES 10，葡萄糖5（pH 7．4）；细胞外液为（mmol／L）：KCl 120，HEPES 10，EGTA 5，ATP－Mg（下标2）4，MgCl（下标2）2，CaCl（下标2）0．5（pH 7．2）。
（3）药物与给药方法根据实验需要用药方法分为压力喷射给药和灌流给药，其中可以采用单管或是多管给药。灌流给药设备相对简单，可以利用重力的作用直接给药，也可以使用不同型号的灌流仪和灌流装置。例如可以用DAD－12导联给药的方法，该给药仪给药时间和量的多少由所设定的程序控制，并能至多观察12个不同浓度的药物，但是该仪器进样却比较麻烦。在此，重点介绍压力喷射给药。
压力喷射给药主要用于观察药物瞬间（毫秒～秒）或短时间（数秒～数十秒）作用时使用的。具体操作是，取硬质有芯玻璃管（外径1．4mm，长12mm），将3根或7根捆绑在一起，用给药电极拉制仪拉制成多管给药电极。多管给药电极的每根玻璃管尖端开口8～12μm。实验中所使用的药物均用细胞外液配制成所需浓度后灌充在给药电极中，每根玻璃管只灌一种药的一种浓度，这样可先后观察1～6种药物或同一药物的几个浓度对同一细胞的作用，便于自身对照。将给药电极与压力注射仪相连，对全细胞记录的细胞进行氮气压力喷射给药。给药电极尖端与记录细胞的距离为20～50μm，喷射压力的调整以在显微镜下观察到药物由给药电极喷出并覆盖记录细胞但不使记录细胞变形或移动为宜，通常为2～6psia。给药持续时间由实验需要决定。为了避免给药电极尖端可能漏出药物对记录细胞产生影响，给药结束后应立即将给药电极移出液面。
三、膜片钳记录的过程
将培养好的细胞从孵育箱取出后，弃去培养皿内的饲养液，加入1．5～2．0ml细胞外液。在倒置相差显微镜下，通过显微操纵仪将充满电极内液的记录电极轻压细胞表面，并通过示波器和放大器的声音监控装置监测电极电阻的变化。当记录电极一接触到细胞膜表面时，由于电极电阻的突然增加，监听器发出的声音频率发生变化，并能同时观察到由放大器或刺激器输出到示波器上显示的封接测试脉冲所代表的电流值下降。然后再使电极稍稍下降，并迅速通过记录电极内部施加10～30cmH（下标2）O负压，使电极和细胞表面形成紧密封接。大部分细胞在形成封接后即可撤除负压，但有时也需要持续负压方能形成高阻封接。封接电阻值可以通过示渡器上封接测试脉冲的变化计算出，通常在2～5GΩ左右。调节放大器进行电容补偿，以抵消由于记录电极管壁形成的瞬时电容电流。此时建立了细胞贴附式记录，在此基础上继续施加负压或用1．5V时程为5～10ms的短时脉冲击破细胞膜，即形成全细胞记录，其特征是在示渡器上观察到来自整个细胞膜的跨膜电容电流，调节放大器进行全细胞电容和串联电阻补偿，以抵消这一电容电流和串联电阻所造成的电压降。全细胞记录状态通常可维持数分钟到数十分钟。
四、数据的采集和分析
采集和处理数据用的pClamp不同版本的软件包（Axon Instrument，美国）如pClamp 8．0由Clampex 8．2，Clampfit 8．2，AXOScope 8．2组成。其中，Clampex 8．2用于采样。采样时数据主要有3种，即个别事件数据、无缝数据和重大事件数据，全细胞记录时对电压门控性离子通道及药物作用的研究用个别事件得到数据。
五、呼吸系统测定法
测定并记录给药前后动物的呼吸频率和呼吸深度的变化。ICH人用药物安全药理学研究指导原则S7A（2000年）指出，呼吸系统的观察指标有，呼吸频率和潮气量或血氧饱和度等呼吸功能指标。以下为麻醉动物测定方法。
【操作步骤】
（1）麻醉最常用的麻醉剂为戊巴比妥钠，狗一般用30mg／kg静脉注射或腹腔注射麻醉，大鼠用40mg／kg腹腔注射麻醉，兴奋型狗的麻醉剂量可增至35～40mg／kg，最好采用静脉注射，便于掌握剂量。戊巴比妥钠麻醉维持时间为2～4h，若手术或实验时间短，可用硫喷妥钠。
（2）固定动物将动物仰卧位固定在手术台上，注意四肢不可束缚过紧以免影响血液循环，用线绳通过门齿将颈部拉直以便手术操作。
（3）沿动物胸骨剑突下约1cm处正中位置透过皮肤穿过手术线。将手术线与张力换能器的一端感应头相连。张力换能器连接于生理记录仪上或生物机能实验系统，由计算机自动采集并保存信息。记录动物呼吸频率、幅度。
（4）纵行剪开颈部皮肤，钝性分离肌层及筋膜，暴露气管。将手术缝合线双线穿过气管下方，留用。在气管软骨作“U”型切口后向心端插入气管导管。用手术缝合线将气管离心端扎紧，并将气管与导管固定。气管导管与呼吸流量描记器相连，由计算机自动采集并保存信息。记录动物呼吸气体流量。
【结果评价】测量给药前及给药后各个时间点动物的呼吸频率、幅度、呼吸流量，计算平均值及SD值。将给药后各个时间点的上述指标与给药前进行t－检验比较，若P＜0．05，表明被试药物对动物呼吸系统有影响。
呼吸频率：指每分钟呼吸的次数，是急性呼吸功能障碍的敏感指标。
呼吸气体流量：单位时间内吸入或呼出的气体容积。
潮气量（tidal volume，TV）：通常是指在静息状态下每次吸入或呼出的气量。每分钟静息通气量（minute ventilation，VE）是静息状态下每分钟出入肺内的气量，等于潮气容积（VT）×呼吸频率（RR）／分钟。
【方法要点】
（1）测定动物呼吸频率、幅度时，手术线结扎的位置随动物的大小有所不同，若动物较小，则距离胸骨剑突下约0．5～1cm，否则应1～2cm。
（2）测定动物呼吸气体流量进行气管插管时，用手术缝合线将气管离心端扎紧，防止分泌物倒流，阻塞气道。如果动物呼吸不规则、气道有呼吸音发出、插管内壁可见分泌物，要及时将分泌物吸出。