（7）举例设供试品为某注射液，预实验中初步确定其最小不干扰稀释倍数为20倍，使用灵敏度为0．25EU／ml的鲎试剂检测供试品是否对内毒素检查存在干扰。
_______________________________________________________________________________
内毒素浓度（EU／ml）0．5 0．25 0．125 0．0625 Nc反应终点浓度
_______________________________________________________________________________
1内毒素标准溶液+++----0．125
2+++----0．125
3+++--0．125
4+++--0．125
_______________________________________________________________________________
1含供试品的++------0．25
2内毒素溶液++------0．25
3++----0．25
4++----0．25
_______________________________________________________________________________
Es=lg的-1次方（ΣXs／4）=lg的-1次方［（lg0．125+lg0．125+lg0．125+lg0．125）／4］=0．125（EU／ml）
Et=lg的-1次方（ΣXt／4）=lg的-1次方［（lg0．125+lg0．25+lg0．25+lg0．25）／4］=0．25（EU／ml）
Et在0．5Es～2．0Es范围内．说明该供试品进行20倍稀释后确已排除干扰作用，在低于或等于此浓度的情况下即可使用细菌内毒素检查法。
3．光度测定法干扰实验
干扰实验的目的同凝胶法干扰实验。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或实验环境中发生了任何有可能影响实验结果的变化时，需重新进行干扰实验。
实验步骤：
（1）标准曲线的制备按照标准曲线溶液的制备方法制各标准曲线系列溶液。
（2）将供试品进行一系列的稀释，但不得超过MVD。
（3）供试品阳性对照液制备，按照光度测定法供试品阳性对照液制备方法制备。
（4）鲎试剂的准备按照光度测定法鲎试剂准备法准备鲎试剂。
（5）加样标准曲线每个浓度不少于2支平行管，供试品每个浓度不少于2支平行管，同时供试品每个浓度的样品阳性对照也不少于2支平行管。并用检查用水做2支阴性对照。
将标准内毒素溶液、供试品、供试品阳性对照和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容器中，再将鲎试剂也按要求的体积加入到反应容器中，轻轻混匀，避免产生气泡，然后将反应容器放人光度测定仪中进行反应。
（6）实验结果计算当反应完毕后，仪器自动生成标准曲线并按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，按下式计算供试品每一浓度的回收率（R）。
R=（Cr－Ct）／λm×100％
（7）结果判断当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于0．980，实验有效。
当供试品的内毒素的回收率在50％～200％之间时，则认为在此浓度下供试品溶液不存在干扰作用。
当供试品系列的内毒素的回收率都不在指定的范围内，可重新制备最低浓度（λ）更低的标准曲线，从而提高MVD，将供试品进行更大倍数的稀释来排除干扰。或按“凝胶法干扰实验”中提及的其他适宜方法去除干扰因素，并要重复干扰实验来验证处理的有效性。
六、供试品细菌内毒素检查
药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查。按照《中国药典》附录，细菌内毒素检查法可分为凝胶法和光度测定法。
（一）凝胶供试品细菌内毒素检查
在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。
实验步骤：
（1）供试品溶液的制备首先接公式计算MVD，然后将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过MVD。
（2）按阳性对照溶液的制备方法制备阳性对照。
（3）供试品阳性对照溶液的制备。
（4）阴性对照液即细菌内毒棠检查用水。
（5）鲎试剂的准备按照鲎试剂的准备方法准备8支（管）鲎试剂，备用。
（6）加样取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0．1ml供试品溶液或其稀释液作为供试品管，2支加入0．1ml阳性对照溶液作为阳性对照管（Pc），2支加入0．1m1检查用水作为阴性对照（NC），2支加入0 lml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（PPC）。
（7）加样后按凝胶法孵育方法孵育，观察记录结果。
（8）结果判断当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验方为有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2管均为阳性。应认为不符合规定；如2管中1管为阳性，1管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至MVD。
（9）举例供试品为葡萄糖注射液，其内毒素限值为0．5EU／ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0．125EU／ml，MVD=C·L=0．5／0．125=4。将样品4倍稀释，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。
____________________________________________________________________
供试品供试品阳性对照阳性对照阴性对照
____________________________________________________________________
--++++--
____________________________________________________________________
结果是否有效有效
____________________________________________________________________
结果判断该批葡萄糖注射液内毒素含量小于0．5EU／ml，符合规定
____________________________________________________________________
（二）凝胶半定量实验
半定量实验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法。系利用供试品系列与鲎试剂反应的终点浓度计算出供试品中内毒素的含量。
实验步骤：
（1）供试品系列的制备用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释，制备成2、4、8等N个浓度，但最大稀释倍数不得超过所使用鲎试剂的MVD．N可根据实验设计不同确定。
（2）内毒素标准系列的制备用检查用水将内毒素标准品稀释成4个浓度的标准溶液即2．0λ、1．0λ、0．5λ、0．25λ。
（3）供试品阳性对照溶液的制备，用已确定不干扰浓度或稀释倍数的供试品溶液将内毒素标准品制成2．0λ浓度的内毒素溶液。
（4）阴性对照液制备。
（5）鲎试剂的准备按鲎试剂准备方法准备鲎试剂12+N支。
（6）加样将准备好的鲎试剂取其中10支（管）放在试管架上，排成5列，每列2支。其中4列每列每支分别加入0．1ml的2．0λ、1．0λ、0．5λ、0．25λ的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0．1ml检查用水作为阴性对照。将另外2N支（管）鲎试剂放在试管架上，排成N列，每到2支（管）。每列每支分别加入0．1ml一个浓度的供试品溶液。另2支（管）加入0．1ml供试品阳性对照溶液作为样品阳性对照。
（7）按照凝胶法孵育方法孵育，并观察记录结果。
（8）结果计算如内毒素标准系列最大浓度2．0λ均为阳性，最低浓度0．25λ均为阴性，阴性对照均为阴性，供试品阳性对照为阳性时．按下式计算内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（λt）和供试品系列溶液反应终点浓度的几何平均值（Ce）。
λt=lg的-1次方（ΣXt／2）
Ce=lg的-1次方（∑Xe／2）
式中，Xt为内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（1g）；Xe为供试品溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。每个系列的反应终点浓度即每一系列平行管的终点稀释倍数D乘以鲎试剂标志灵敏度λ，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度。
（9）结果判断当λ在0．5λ～2λ之间，实验方为有效。供试品的内毒素含量即为供试品系列反应终点浓度的几何平均值。如果实验检验的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。如实验中供试品溶液的结果都为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记录为小于λ×该供试品的最低稀释倍数）。如果结果都为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。
（10）举例设供试品为某注射液，干扰实验已确定其最小不干扰稀释倍数为20倍，其内毒素限值为10EU／ml，现使用灵敏度为0．03EU／ml的鲎试剂检测供试品中的内毒素含量。
MVD=C·L／λ=10／0．03≈320倍
将供试品溶液先稀释至20倍后，再进行对倍稀释。将20倍稀释液再稀释2、4、8、16倍，同时制备内毒素标准系列。
___________________________________________________________________________________
内毒素浓度（EU／ml）0．0625 0．03 0．015 0．0075 Nc反应终点浓度
___________________________________________________________________________________
内毒素标准溶液+----0．0625
+----0．0625
___________________________________________________________________________________
供试品稀释倍数1 2 4 8 16 PPC反应终点稀反应终点浓
释倍数D度D×λ
___________________________________________________________________________________
供试品系列++++-+8 0．24
+++--+4 0．12
___________________________________________________________________________________
λt=lg的-1次方（ΣXt／2）＝lg的-1次方［（lg0．0625+lg0．0625）／2］=0．0625（EU／ml）
Ce=lg的-1次方（∑XE／2）
=lg的-1次方[（lg0．24+lg0．12）／2]=0．170（EU／ml）
λ在0．5λ—2λ之间，实验为有效。
供试品20倍稀释液的内毒素含量为0．170 EU／ml。
由于供试品先被稀释了20倍．因此供试品的内毒素含量为0．170×20=3．40EU／ml，低于规定的内毒素限值，此批注射液内毒素检查项符合规定。
（三）光度测定法细菌内毒素检查
（1）按照仪器要求设置。
（2）标准曲线的制备。
（3）将供试品稀释至一个已证实无干扰作用的浓度，并同时制备该浓度下的供试品阳性对照。
（4）鲎试剂的准备及加样标准曲线每个浓度不少于2支平行管，供试品不少于2支平行管，供试品阳性对照也不少于2支平行管。并用检查用水做2支阴性对照。
将标准内毒素溶液、供试品、供试品阳性对照和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容器中，再将鲎试剂也按要求的体积加入到反应容器中，轻轻混匀，避免产生气泡，然后将反应容器放入光度测定仪中进行反应。
（5）结果判断当反应完毕后，使用标准曲线来计算供试品的每一个平行管的内毒素浓度。
实验必须符合以下三个条件方为有效：①标准曲线的结果要符合“标准曲线的可靠性实验”中的要求；②该浓度下的内毒素回收率要在50％～200％的范围内；③阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间。
若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。