免疫PCR技术目前主要用于检测肿瘤标志物、激素、细胞因子、神经内分泌活性多肤、病毒抗原、细菌、酶、支原体、衣原体等微量抗原。此外，免疫PCR技术还在自身免疫性疾病的检测中有所应用。在对疫苗免疫后的效果评价（特别是免疫较长时间后的评价）、极微量可溶性细胞受体、激素和细胞因子的检测方面，免疫PCR技术也会大有发展。
（一）免疫PCR方法的关键因素
免疫PCR方甚的成功建立取决于三个关键因素：抗体和DNA的交联、扩增DNA的检测、不同抗原／半抗原超灵敏检测分析中本底信号的扣除，而这三个因素又对应于免疫PCR系统的四个子系统，即抗原一抗体反应、桥联、指示和检测系统。
1．抗原—抗体反应系统在免疫PCR过程中，免疫反应要求固相载体对抗原包被均匀、结合稳定；PCR反应要求固相载体导热性能好、耐高温、液面小且不易挥发=因此，选择合适的固相载体是免疫PCR技术的重要因素。目前应用的固相载体主要有聚碳酸酯微孔板、聚氯乙烯微孔板以及聚丙烯PCR管等。日前免疫PCR技术所用的同相载体多为微孔板或PCR反应板中的一种，且需根据自己所用材质的不同进行相应处理。但随着技术的不断进步，NUNC公司现在已经设计出同时适用于免疫反应和PCR反应的Top Yield微孔板，可以适用于ABI公司和其他公司的PCR仪，从而有利于免疫PCR技术的自动化。
2．桥联系统
是指连接抗原一抗体反应系统与DNA分子指示系统之间的连接分子或复合物。目前应用的桥联系统主要有：
（1）链亲和素亿抗体／蛋白A—生物素化DNA系统。
（2）生物素化抗体—亲和索—生物素化DNA系统其基本方法是先将亲和素和生物素化的DNA预结合成复合物，然后与结合固相的生物素化的特异性抗体结合。
（3）抗体—叶绿素—DNA系统利用自然界广泛存在的叶绿素作为连接分子进行抗体与DNA的交联。这种方法具有较好的稳定性，且成本低，但该法叶绿素的提取和纯化及除交联外的其它过程均需在黑暗处进行，而交联却需在特定光下进行，放实际操作中很不方便。
（4）抗体—DNA系统用化学交联剂直接将DNA与抗体连接起来。使用的交联剂有聚乙烯亚胺和碳化二亚胺等一些双功能交联剂。该方法完全摆脱了生物素一亲和素系统的本身价态而造成的灵敏度和准确性下降的问题，也免去了几次洗涤步骤，减少了指示系统与固相载体的非特异结合，节省了时间。
3．指示系统
是指所采用的标记DNA分子。在免疫PCR的研究中，研究人员采用了多种指示分子。从DNA分子的性质来看分为双链DNA和单链DNA。①单链DNA：Joerger等用合成的单链99个碱基的DNA分子标记hcG抗体，用合成的单链85个碱基的DNA分子标记hTSH抗体，同时检测hcG和hTSH。合成单链DNA均一性好，但成本较高；②双链DNA：从其来源看，主要有PCR扩增得到的短片段DNA以及处理后的载体DNA分子。质粒DNA易获得，均一性好，成本低，但需酶切转化为线性质粒DNA并进行纯化。PCR产物同质粒DNA的优点一样，只是需要进行PCR产物纯化。Joerger等认为双链DNA标记物较之单链寡核苷酸有一些优点：双链DNA可能增加标记物的稳定性；双链DNA中未与抗体结合的链在PCR的第一个循环变性阶段即可从抗体上脱落下来，消除了变性抗体对PCR扩增的空间位阻；双链DNA更适合于荧光检测和以杂交为基础的检测等多种检测方式。
理论上，免疫PCR中的指示系统可以选择任何DNA分子，但在实际应用中可按以下原则选择。
（1）DNA分子具有较高的纯度，均一性好，为满足后续工作的需要，应具有合理的碱基分布（如G＋C含量达40％～60％；不具有多个连续的相同碱基等）。
（2）易于扩增，引物容易设计，退火温度适中。
（3）指示分子和待检样品中可能存在的DNA分子不具有同源性。因此，在选择指示系统时可以参照选取原则选择指示系统，谨在此推荐使用双链PCR产物作为指示系统，为方便后续的检测，PCR产物长度在200～400bp左右。
4．检测系统
免疫PCR的检测系统一般有4种。
（1）紫外透射法免疫PCR的结果一般可以通过凝胶电泳、溴乙啶染色来检测并定量分析。
（2）放射自显影法将带有同位素标记的dCTP作为PCR的底物之一，PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并放射自显影，将含DNA的带切下后测定放射活性。此法灵敏度高，但存在同位素污染的危险，因此不利于推广。
（3）标记探针杂交法在PCR的引物5′端标记不同的生物分子如生物素和地高辛等，完成扩增后将扩增产物变性后迅速冷却，与标有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β－半乳糖苷酶的寡聚探针混合，温育于包被有和引物标记分子相对应的配体的微孔板内，洗去未结合物后加入酶底物显色，观察结果。
（4）实时荧光测定将指示分子通过化学交联剂与抗体交联，利用荧光定量PCR仪检测指示分子，通过PCR测定出指示分子的量与检测标本中特异性抗体的水平呈正相关来推算样品中特异性抗体的含量。荧光定量PCR避免了溴乙啶和同位素等物质的污染，结果可以实时分析报告。免疫PCR与实时定量PCR结合产生的实时定量免疫PCR技术具备了双方的优点，在保证特异性和敏感性的同时简化了实验操作，缩短检测周期，还可以对检测分子进行精确定量，在疾病检测中具有广泛应用前景。
（二）操作程序和方法
以生物素－链亲和素系统为例，它形成生物素化抗体－链亲和素－生物素化DNA分子复合体。其操作程序如下。
（1）抗原＋生物素化抗体→抗原－生物素化抗体复合物。
（2）加入链亲和素抗原→生物素化抗体－亲合素复合物。
（3）加入生物素化DNA探针→抗原－生物素化抗体－亲和素－生物素化DNA复合物。
（4）PCR扩增生物素化DNA探针。
【操作步骤】
（1）抗原制备。
（2）45μl适当稀释的抗原（150mmol／L NaCl，20mmol／L Tris HCl pH 9．5，0．02％NaN（下标3）配制）加入微量滴定板孔中，4℃，过夜（15h以上）以固相化抗原。
（3）250μl Tris盐酸缓冲液漂洗（TBS，150 mmol／L NaCl，20mmol／L Tris HClpH 7．5，0．02％NaN（下标3）），5min，3次。
（4）每孔加200μl ETBS（TBS加上0．1 mmol／L EDTA，含4．5％脱脂奶粉和变性鲑鱼精DNA 1g／L），37℃，80min，封闭非特异性结合位点。
（5）150μl TETBS（TBS加上0．1 mmol／L EDTA，0．1％Tween 20）漂洗，5min，7次。
（6）每孔加50μl含有0．45％脱脂奶粉，变性鲑鱼精DNA（0．1g／L）和TETBS适当稀释的抗体。室温，45min。
（7）250μl TETBS漂洗，10min，15次，去除未结合的抗体。
（8）每孔中加入50μl含有0．45％脱脂奶粉、变性鲑鱼精DNA（0．1g／L）及1．4×10（上标16）mol／L能与链霉亲和素－蛋白嵌合蛋白耦连的生物素化线性质粒pUC19耦连物与抗原抗体复合物结合。
（9）250μl TETBS漂洗，10min，15次，去除未耦连物。
（10）用不含NaN（下标3）的TBS漂洗，3次。
（11）PCR反应体系，50mmol／L KCl，10mmol／L Tris HCl（pH 8．0），1．5mmoL／L MgCl（下标2），明胶（10mg／L），4种0．8 mmol／L dNTPs（每种0．2 mmol／L），2μmol／L引物（每种1μmol／L），TaqDNA聚合酶50U／ml。将PCR反应液加入微量滴定板孔中，每孔40μl，然后加入20μl无菌矿物油。
（12）PCR循环将微量滴定板放入PCR扩增仪中，第一次变性94℃，5min，然后经过94℃变性，Imin，50℃退火，1min，72℃延长，1min，30个循环。最后一次循环延长72℃，5min。
（13）取5μl扩增产物，电泳（2％琼脂糖／TBE）100V，电泳30min，紫外灯观察电泳结果。
五、荧光定量PCR技术
自Holland等（1991年）率先提出一种利用双标记寡核苷酸杂交探针和DNA聚合酶的5′端外切酶活性检测PCR到1996年由美国Applied Biosystems公司推出成熟的荧光定量PCR技术，对PCR产物进行准确定量已成为PCR技术发展的重要方向。荧光定量PCR技术广泛应用于核酸定量等领域。以其快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、可实时监测及自动化程度高等其他方法无法比拟的优点成为核酸检测的重要工具，弥补了一般技术对疾病亚临床或潜伏感染无法确诊的缺点。
（一）荧光定量PCR原理
荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行实时监测和连续分析荧光信号，随着反应时间的延续，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并由此推断模板最初的含量。
为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝数，荧光定量PCR采用参数“Ct”值，所谓C代表循环（cycle），t代表域值（threshold）。Ct循环阈值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。研究结果表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光PCR将扩增和检测合二为一，降低了人为因素的误差，使检测自动化水平大幅度提高。
（二）荧光定量PCR的定量方法