分子杂交技术（molecular hybridization）是在研究DNA分子复性变化基础上发展起来的一种技术。其原理是，具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA－DNA，DNA－RNA或RNA－RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列问是否具有互补关系。杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
杂交的双方是所使用的探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交，即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素，但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用，而且在临床诊断上的应用也日趋增多。
一、核酸探针标记的方法
核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针；根据是否使用放射性标记物的与否，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针；根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针；根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。
（一）双链DNA探针及其标记方法
分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的台成方法主要有下列两种：切口平移法和随机引物合成法。
1．切口平移法（nick translation）
【基本原理】当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E．coli聚合酶I就可将核苷酸连接到切口的3＇羟基末端。同时该酶具有从5＇→3＇的核酸外切酶活性，能从切口的5＇端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3＇端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50～500个核苷酸。
【影响因素】
（1）产物的比活性取决于［α－（上标32）P］dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。
（2）DNA酶I的用量和E．coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。
（3）DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性，故应使用纯化后的DNA。
【实验前准备】
（1）材料待标记的DNA。
（2）设备高速台式离心机，恒温水浴锅等。
（3）试剂10×切口平移缓冲液：0．5mol／L Tris·CI（pH 7．2）；0．1mol／LMgSO（下标4）；10mmol／L DIT；100μg／ml BSA。来标记的dNTP原液：除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外，其余3种分别溶解于50mmol／L Tris·Cl（pH 7．5）溶液中，浓度为0．3mmol／L。［α－（上标32）P］dCTP或［α－（上标32）P］dATP：400 Ci／mmol，10μCi／μl。E．coli DNA聚合酶I（4单位／μl）：溶于500μg／ml BSA，1mmol／L DTT，50％甘油，50mmol／L Tris·cl（pH 7．5）中。DNA酶I：1mg／ml。EDTA：200mmol／L（pH8．0）。10mol／L NH（下标4）Ac。
【操作步骤】
（1）按下列配比混合
末标记的dNTP 10μl
10×切口平移缓冲液5μl
待标记的DNA 1μg
［α－（上标32）P］dCTP或dATP（70μCi）7μl
E．coli DNA聚合酶4u
DAN酶I 1μl
加水至终体积50μl
（2）置于15℃水浴60min。
（3）加入5μl EDTA终止反应。
（4）反应液中加入醋酸铵，使终浓度为0．5mol／L，加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀，回收DNA探针。
【注意事项】
（1）（上标3）H，（上标32）及（上标35）S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用［α－（上标32）P］－dNTP。
（2）DNA酶I的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶I活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。
2．随机引物合成法
随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400～600个核苷酸。
利用随机引物进行反应的优点是：①Klenow片段没有5＇→3＇外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针。②反应时对模板的要求不严格。用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。③反应产物的比活性较高，可达4×10（上标9）cpm／μg探针。④随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。
【实验前准备】
（1）材料待标记的DNA片段。
（2）设备高速台式离心机，恒温水浴锅等。
（3）试剂随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。10×随机标记缓冲液：900mmol／L HEPES（pH 6．6）；10mmol／L MgCl（下标2）。Klenow片段。20mmol／LDTT。未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol／L。［α－（上标32）P］dATP：比活性＞3000Ci／mmol，10μCi／μl。缓冲液A：50mmol／L Tris·CI（pH7．5）；50mmol／L NaCl；5mmol／L EDTA（pH 8．0）；0．5％SDS。
【操作步骤】
（1）200ng双链DNA（1μl）和7．5ng随机引物（1μl）混合后置于eppendorf管内，水浴煮沸5min后，立即置于冰浴中1min。
（2）与此同时，尽快在一置于冰浴中的0．5ml eppendorf管内混合下列化合物：
20mmol／L DTT 1μl
未标记的dNTP溶液1μl
10×随机标记缓冲液1μl
［α－（上标32）P］dATP（比活性＞3000Ci／mmol；10μCi／μl）3μl
ddH（下标2）O 1μl
（3）将步骤（1）Eppendorf管中的溶液移到步骤（2）管中。
（4）加入5u（约1μl）Klenow片段，充分混合，在微型离心机中以12000g离心1－2s，使所有溶液沉于试管底部，在室温下保温3～16h。
（5）在反应液中加入1Oμl缓冲液A后，将放射性标记的探针保存在－20℃下备用。同时计算放射比活性。
【注意事项】
（1）引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。
（2）模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50％。
（二）单链DNA探针
用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时，探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种：①以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针；②以RNA为模板，用反转录酶合成单链cDNA探针。
1．以M13载体衍生序列为模板，用Kleaow片段合成单链探针
合成单链DNA探针可将模板序列克隆到质粒或M13噬苗体载体中，以此为横板，以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物，在［α－（上标32）P］－dNTP的存在下，由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物，然后通过变性凝胶电泳（如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）将探针与模板分离开。
【实验前准备】
（1）材料已制备好的单链DNA模板。
（2）设备高速台式离心机，恒温水浴锅等。
（3）试剂10×Klenow缓冲液：0．5mol／L NaCl，0．1mol／L Tris·Cl（pH 7．5），0．1mol／L MgCl（下标2）。0．1mol／L DDT溶液。［α－（上标32）P］dATP：3000Ci／mmol，10μci／μl。40mmol／L和20mmol／L的未标记的dNTP溶液。dCTP，dTTP，dGTP各20mmol／L的溶液。Klenow片段（5U／ml）。适宜的限制酶，如EcoR I、HindⅢ等。0．5mol／LEDTA（pH 8．0）。
【操作步骤】
（1）在0．5ml eppendorf管中混合如下溶液：
单链模板（约0．5pmol）1mg
适当引物5pmol
10×Klenow缓冲液3ml
加水至20ml
（2）将Eppendorf管加热到85℃5min，在30min内，使小离心管降到37℃；
（3）依次加入DTT 2ml；［α－（上标32）P］dATP 5ml；未标记的dATP 1ml；dGTP，dCTP，dTTP混合液1ml。混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。
（4）加1ml（5U）Klenow酶室温下30min。
（5）加1ml 20mmol／L，未标记的dATP溶液20min。
（6）68℃加热10min，使Klenow片段失活。调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。
（7）加入20U限制性内切酶（如EcoRⅠ，HindⅢ等）酶切1h。
（8）酚／三氯甲烷抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0．5mol／L EDTA（pH8．0）至终浓度10mmol／L。
（9）用电泳方法分离放射性标记的探针。
2．从RNA合成单链cDNA探针
cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种：①用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly（A）的mRNA，并且产生的探针大多数偏向于mRNA 3＇末端序列。②可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点，产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子，所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多，应预先尽量富集mRNA中的目的序列。
反转录得到的产物RNA／DNA杂交双链经碱变性后，RNA单链可被迅速地降解成小片段，经SepHadex G－50柱层析即可得到单链探针。
【实验前准备】
（1）材料已提纯的RNA或mRNA
（2）设备高速台式离心机，恒温水浴锅等。
（3）试剂合适的引物：随机引物或oligo（dT）15－18。5mmol／L dGTP，dATP，dCTP，dTTP。［a－（上标32）P］dCTP（＞3000Ci／mmol，10mCi／ml）。反转录酶（20万U／ml）。100mmol／L DTT。250mmol／L MgCl（下标2）。1mol／L KCl。0．5mol／L EDTA（pH8．0）。10％SDS。RNasin（40U／ml）。
【操作步骤】
（1）在已置于水浴中的灭菌离心管中加入下列试剂
RNA或mRNA 10．0ml
合适的产物（1mg／ml）10．Oml
1mol／LTris·C1（pH7．6）2．5ml
1mol／L KCl 3．5ml
250mmol／L MgCl（下标2）2．0ml
5mmol／L dNTP 10．0ml
［α－（上标32）P］dCTP 10．0ml
0．1mol／L DTT 2．0 ml
RNasin 20U
加水至48ml
反转录酶（20万U／ml）2ml
混匀后，稍稍离心，37℃保温2h。
（2）反应完毕后加入下列试剂0．5mol／L EDTA（pH 8．0）2ml 10％SDS 2ml。
（3）加入3ml 3mol／L NaOH。68℃保温30min以水解RNA。
（4）冷却至室温后，加入10ml 1mol／L Tris·C1（pH 7．4）。混匀。然后加入3ml2mol／L HCl。
（5）酚／氯仿抽提后，用SepHadexG－50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。
【注意事项】RNA极易降解，因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC处理后，灭菌备用。
（三）末端标记DNA探针
现以Klenow片段标记3＇末端为例说明末端标记的方法。
【实验前准备】
（1）材料待标记的双链含凹缺3＇末端的DNA。
（2）设备高速台式离心机，水浴锅等。
（3）试剂3种不含标记的dNTP各为200mmol／L。合适的限制酶。［α－（上标32）P］dNTP：3000Ci／mmol，10mCi／μl。Klenow片段（5U／ml）。10×末端标记缓冲液：0．5mol／L Tris·Cl（pH 7．2），0．1mol／L MgSO（下标4），1mmol／L DTT。500mg／ml BSA。
【操作步骤】
（1）25μl反应体系中用合适的限制酶酶切1μg的DNA。
（2）按下列成分加入试剂并混匀：已酶切的DNA 1mg、10×末端标记缓冲液5ml、2mmol／L 3种dNTP lml、［α－（上标32）P］－dNTP适量、加水至50ml
（3）加入1单位的Klenow片段，室温下反应30min。
（4）加入1ml 2mmol／L第四种核苷酸溶液，室温保温15min。
（5）70℃加热5min，终止反应。
（6）用酚／氯仿抽提后，用乙醇沉淀来分离标记的DNA，或用SepHadex G－50柱层析分离标记的DNA。
【注意事项】
（1）利用本方法可对DNA分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段。
（2）对DNA的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。
（3）末端标记还有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5＇端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该酶进行交换反应标记5＇末端。
（四）寡核苷酸探针
利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种：单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对，可以准确地设计杂交条件，以保证探针只与目的序例杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交，对于一些未知序列的目的片段则无效。
【实验前准备】
（1）材料待标记的寡核苷酸（10pmol／μl）。
（2）设备高速离式离心机，恒温水浴锅等。
（3）试剂10×T4多核苷酸激酶缓冲液：0．5mol／L Tris·CI（pH 7．6），0．1mol／L MgCl（下标2），50mmol／L DTT，1mmol／L Spermidine·HCl，1mmol／L EDTA（PH8．0）。［γ－（上标32）P］ATP（比活性7000Ci／mmol；10mCi／ml）。T4多核苷酸激酶（10单位／ml）。
【操作步骤】