《蒙娜丽莎》中的主人公是当时的新贵乔孔多的年轻妻子蒙娜丽莎。那时，蒙娜丽莎的幼子刚刚夭折，她一直处于哀痛之中，闷闷不乐。为了让女主人高兴起来，达·芬奇在作画时甚至请来音乐家和喜剧演员。达·芬奇用了4年工夫，期间为了消除蒙娜丽莎摆姿势的疲倦，还请弹竖琴的人在一旁演奏。当这幅肖像画画好后，来观看的人都说，比真人还要生动。
这幅画最成功的地方在于画中人物微妙至极的表情。无论从哪个角度看，她似乎都在凝视着观者，嘴角微微向上翘起，所反映出来的心理状态更加令人难以琢磨，这也使得500年来人们一直对她的微笑争论不休。不同的观者或在不同的时间去看，感受似乎都不同。有时觉得她笑得舒畅温柔，有时又显得严肃，有时像是略含哀伤，有时却显出讥嘲和揶揄。在一幅画中，光线的变化不能像在雕塑中产生那样大的差别，但在蒙娜丽莎的脸上，微暗的阴影时隐时现，为她的双眼与唇部披上了一层面纱。人的笑容主要表现在眼角和嘴角上，达·芬奇却偏把这些部位画得若隐若现，没有明确的界限，因此才会产生这令人捉摸不定的“神秘的微笑”。
这幅画完成后，端庄美丽的蒙娜丽莎脸上那神秘的微笑使无数人为之倾倒。人们对那微笑进行了种种猜测：是和蔼可亲的温婉的微笑？是多愁善感的感伤的微笑？它的诱人之处，全在于那微笑的神秘莫测和令人倾倒。画中人物交叠的双手是画面里另一个闪光点。这双柔嫩的手被画得那么精确与丰满，完全符合解剖结构，充分展示了她的温柔，与神秘的微笑相映生辉，在庄重的坐姿上又增添了几分宁静与安详。
在绘画技巧上，达·芬奇精心处理了画面里所有物体的轮廓，以至于观者很难从中找到一条清晰而实在的边线。相反，在每一处形体发生转折的部位，却可以感觉到无数细腻而微妙的层次过渡。这是一种达·芬奇独创的画法，它如同给画面罩上了一层薄雾，在多少有些混沌的状态中带给人以生动而深邃的感受。
在构图上，达·芬奇改变了以往画肖像画时采用侧面半身或截至胸部的习惯，代之以正面的胸像构图，透视点略微上升，使构图呈金字塔形，画中人物就显得更加端庄、稳重。人物背后的风景，并非只是人物的装饰或陪衬，而是透露着理解这幅作品的一些关键信息。有学者考证，背景中描绘的是远古时代意大利佛罗伦萨地区的阿诺河河谷的地貌风景，达·芬奇曾对沿河的阿斯卡那地貌进行过深入的研究。这种对自然地理的研究与对人体解剖学的研究，在这幅画中得到完美结合。画面上，人物衣纹构成的弧线与折线同背景中流淌的河水交相辉映，而人物头发细小的波浪则宛如远处山崖瀑布上冲下的水流。更为重要的是，背景中的阿诺河河谷保持了它原始的状态，而近处的人物也单纯朴素地摘除了所有装饰，除了头上那层薄薄的黑纱（它在当时的意大利含有“贞洁”的隐义）。
画中人物就像一位集人类众多美德于一身的圣母，端庄地坐于历史的原点之前，打动人心的不仅是她的美，还有一种蕴藏着宇宙感的宏伟壮丽。人们过分地喜爱她，无止境地探讨她那难以觉察的、转瞬即逝然而亘古不变的微笑，那洞察一切而又包容一切的眼神，那端庄沉稳的姿态，高贵而朴素的装束，以及无懈可击的完美构图。蒙娜丽莎带给人们无限美好的遐想。
当年达·芬奇迁居法国，身边就带着这幅画；达·芬奇死后，《蒙娜丽莎》即为法国王室所拥有；卢浮宫建成后，此画就被永久收藏。
如今，美丽神秘的《蒙娜丽莎》淡然地置于卢浮宫一处显要的位置，隔着厚厚的防弹玻璃，每天以我们熟知的、神秘而永恒的微笑迎候数以万计的来访者。
《蒙娜丽莎》是一幅传世之作，蒙娜丽莎那神秘的微笑令无数人倾倒。画作单纯浑厚的色调与人物沉静内敛的精神气质相得益彰；深暗的衣饰、迷蒙的背景和均匀的裂纹，使得蒙娜丽莎的脸庞更加生动明亮。《蒙娜丽莎》不仅是法国人的骄傲，也是全世界的骄傲，是人类艺术史上的一幅杰作。