第一节细菌培养基
培养基是按照微生物的生长要求配制成的一种人工营养制品，主要作为繁殖细菌微生物、分离细菌微生物、鉴定细菌微生物、保存和研究细菌微生物以及制造生物制品等用。培养细菌必须有适于细菌生长繁殖的培养基。不同种类的细菌对营养的要求有显著的差别。培养基是用人工的方法，将多种营养物质根据各种细菌生长的需要而合成的一种混合营养料。培养基中通常含有能被细菌利用的碳源、氮源、无机盐和水等物质。一般说来，微生物对未经消化的蛋白质利用率较差，因此需要比较简单的含氮物质，如氨基酸、蛋白胨、蛋白及多肽类等。某些细菌更需要类似维生素类的辅助生长因素或其他某些特殊因子才能生长。因此要培养好细菌，首先要掌握细菌生长需要的条件，以便去制备各种培养基。
随着微生物的发展，培养基的种类与日俱增。同一种类的培养基，因原料品种的不同而有质量上的差异。因此选择用于特殊要求的合适培养基，需要有相当丰富的工作经验。为了保证工作质量，节约制备大量品种培养基的时间，目前通常采用现成的各种干粉培养基成品，用蒸馏水配制而成，此种培养基使用方便。制备培养基时必须注意如下事项：①培养基必须含有细菌所需的各种营养物质，如蛋白胨、碳水化合物及盐类；②培养基必须含有合适的水分，因为细菌主要靠液体以弥散和渗透等方式摄取营养；③多数致病菌对酸碱值的变化均敏感，故所用的培养基需要调整pH，通常为pH7.2～7.6，即适合多数细菌的生长。测pH须在冷后测定，因培养基所含成分不同，在冷或热时测定pH相差较大。④制造及装培养基的容器不应含有抑制细菌生长繁殖的物质，制造培养基的容器最好用搪瓷锅和铝锅，不用铜锅与铁锅。⑤制造培养基所用化学药品，均需化学纯以上，且各种成分要准确准量。⑥制造的培养基应均质透明。⑦培养基必须彻底灭菌，且应杂检。下面介绍一些常用的培养基及其制备方法。
一、普遍培养基
1.营养肉汤（Beef infusion broth）
成分：牛肉浸液1000ml
蛋白胨10.0g
氯化钠5.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0g
制备方法：取定量牛肉浸液，加入其他各成分，加热溶化，补足失去水分。调pH到7.2～7.6（每升加0.1N NaOH约20ml），滤纸过滤，分装；121℃15—20min消毒灭菌，4℃冰箱保存备用。
用途：供一般细菌生长的液体培养基，生长后可检查其生长情况（混浊度、沉淀、菌膜等）也是制作固体培养基的基础培养基。
2.肉膏汤（Beef extract broth）
成分：牛肉膏5.0g
蛋白胨5.0g
氯化钠5.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0g
蒸馏水1000ml
制备方法：将上述各成分混合，加热溶化，调整pH到7.4～7.6，过滤分装，121℃15—20min消毒灭菌，4℃冰箱保存备用。
用途：同营养肉汤。
3.马丁肉汤（Martin，s broth）
成分：猪胃消化液1份
普通肉汤1份
制备方法：猪胃消化液，取去脂肪并绞碎的猪胃200g，加蒸馏水？？？？ml，浓盐酸10ml，置50—60℃水浴中消化18—24h，取出后100℃10—20min煮沸使消化停止。放冰箱24h，弃去上浮脂肪，吸取上清液，纱布过滤。经流动蒸汽消毒器中加热30—40min，调整pH值为8.2，过滤分装，121℃灭菌20min。
取等量猪胃消化液和普通肉汤混合，煮沸10min，调整pH到7.6～7.8，分装，115℃灭菌30min，4℃冰箱保存备用。
用途：用于培养猪丹毒杆菌及营养要求较高的细菌。
4.营养琼脂（Nutrient agar）
成分：营养肉汤（或肉膏汤）1000ml
琼脂粉20—30g。
制备方法：将琼脂加入到营养肉汤中，加热使之融化；调pH到7.2～7.6；用纱布过滤，分装，121℃灭菌20min，4℃冰箱保存备用。
用途：一般细菌培养、菌种保存或供制备血液琼脂等培养基的基础。
5.半固体（Semisolid agar）培养基
成分：营养肉汤（pH7.2～7.6）100ml
琼脂粉0.3—0.5g
制备方法：将琼脂加入到营养肉汤中，加热使之融化；调pH7.6；用纱布过滤，分装，121℃灭菌15—20min，4℃冰箱保存备用。
用途：用于菌种保存，细菌运动性观察。
6.血液琼脂（Blood agar）
成分：营养琼脂（pH7.4～7.6）100ml
无菌脱纤血或抗凝血5—6ml
无菌鲜血的制备：以无菌手术采取健康动物（通常是绵羊或家兔）血液，加到盛5％柠檬酸钠溶液的容器中（血与抗凝剂之比为9：1），混匀；或加到盛有灭菌玻璃珠的容器里，反复摇动多次制成脱纤血，置冰箱中备用。
将灭菌的营养琼脂加热融化，冷却至45-50℃时，加入5％～10％无菌鲜血（一般为绵羊或兔血），分装试管，摆成斜面或倾注于平皿，待凝固后，置37℃培养1～2d，有污染者废弃，无菌者保存于4℃冰箱备用。
用途：用于营养要求较高细菌的分离培养及观察细菌的溶血作用。
7.厌气肉肝汤（Anaerobi broth with liver）
成分：牛肉1份
牛（羊、猪）肝1份
水4份
蛋白胨1％
氯化钠0.5％
葡萄糖0.2％
小肝块1/10，液体石蜡适量。
制备方法：取除脂肪与筋膜的牛肉，用绞肉机绞碎，加入切成100g左右的肝块各一块，加蒸馏水4份；煮沸30—60min，补足失去的水分，用白布过滤，弃去肉渣，取出肝块，滤液加入蛋白胨l％和氯化钠，加热溶化；将煮过的肝块洗净，切成小方块，用蒸馏水充分冲洗后，分装于试管中或中性玻璃瓶内，其量约为预计分装肉肝汤量的1/10；将滤液分装于含有肝块的中型容器中（如为试管，还应加适量的液体石蜡），以121℃高压灭菌30min。
用途：供一般厌气菌培养与无菌检验应用。
8.石蕊牛奶培养基
成分：脱脂牛奶1000ml
石蕊溶液适量。
制备方法：取精制石蕊颗粒1g加蒸馏水60ml，使充分溶解，用粗滤纸滤后制成石蕊溶液。取新鲜牛奶，脱去乳脂；加入石蕊溶液，使之成淡紫色；分装于试管中，可加适量液体石蜡；115℃高压灭菌20min。
用途：用于一般细菌鉴定之用。用于厌氧菌的鉴定可加适量液体石蜡。
二、特殊培养基
1.用于肠道菌的培养基
1.1麦糠凯（Macconkey）琼脂
成分：蛋白胨20g
琼脂20～25g
氯化钠5g
乳糖（CP）l0g
胆盐（3号胆盐或牛胆酸钠）5g
1％中性红水溶液5ml
蒸馏水1000ml
制备方法：除中性红水溶液外，其余各成分混合于锅内加热溶解。调pH到7.2～7.4，煮沸，用脱脂棉过滤。加入1％中性红水溶液，摇匀，121℃高压灭菌15min。冷却至50℃，倾倒平皿。平皿内培养基凝固后，置温箱内烤干表面水分即可应用。可保存于4℃冰箱内。也可用厂家专门配制、出售的麦糠凯琼脂干粉剂，用时，加水溶解，灭菌.
用途：肠道致病菌的分离。对乳糖发酵菌的菌落呈红色。不发酵的沙门氏菌和痢疾杆菌呈无色透明。
1.2三糖铁琼脂（Triple Sugar iron agar）
成分：蛋白胨20g
琼脂12g
牛肉膏3g
乳糖l0g
蔗糖l0g
酚红0.25g
葡萄糖lg
氯化钠5g
硫代硫酸钠0.3g
酵母浸膏3g
枸橼酸铁0.3g
蒸馏水1000ml
制备方法：各成分混合后加热煮沸溶解。调pH到7.2—7.4，分装于容积15ml的试管，每管10m1，121℃高压灭菌15min。趁热放置成底层约2.5cm高的斜面。也可用厂家专门配制、出售的三糖铁琼脂干粉剂，用时，加水溶解，灭菌即可。
用途：从选择性平板上挑可疑菌落接种于此培养基上作纯培养，观察葡萄糖、乳糖、蔗糖的发酵反应，并可观察H2S的产生。常用于肠杆菌科生化鉴定。
1.3SS琼脂
成分：蛋白胨5g
琼脂20～25g
牛肉膏5g
乳糖（CP）l0g
胆盐（3号胆盐或牛胆酸钠）10g
0.5％中性红水溶液4.5ml
枸橼酸钠10～14g
0.1％亮绿溶液0.33ml
硫代硫酸钠8.5g
枸橼酸铁0.5g
蒸馏水1000ml。
制备方法：除中性红与亮绿溶液外，其余各成分混合于锅内加热溶解。调pH到7.0～7.2，煮沸，用脱脂棉过滤。加入中性红与亮绿溶液，摇匀，加热煮沸溶解。冷却至45℃，倾倒平皿。制备好的培养基应在2～3d内用完。亮绿溶液配好后置于暗处，于一周内用完。也可用厂家专门配制、出售的SS琼脂干粉剂，用时，加水溶解，灭菌即可。
用途：肠道致病菌的分离。本培养基不能高压灭菌或加热过久。平板使用前应倒置培养箱中烘干。
1.4增菌培养基（缓冲蛋白胨水）
成分：蛋白胨l0g
氯化钠5g
磷酸二氢钠0.15g
蒸馏水l 000ml
制备方法：各成分混合后加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15min即可。
用途：用于分离沙门氏菌等肠道菌的增菌培养基。也可用厂家专门配制、出售的干粉剂，用时，加水溶解，灭菌即可。
1.5亚硒酸盐培养基
成分：胰胨10g
磷酸氢二钠4.5g
磷酸二氢钠5.5g
亚硒酸氢钠4g
蒸馏水1000ml
制备方法：上述各成分除亚硒酸钠外，混合加热100℃，10～15min，冷却至40～50℃时，加入亚硒酸钠，分装。已有市售亚硒酸盐干粉培养基出售，加水，溶解，灭菌后即可用。
1.6H.E琼脂（Hektone肠道用培养基）
基础液：乳糖12g
水杨素2g
蔗糖12g
示蛋白胨12g
3号胆盐20g
牛肉膏3g
氯化钠5g
琼脂18g
蒸馏水1000ml
制备方法：上述各成分加热溶解，调pH至7.2，加0.4％溴麝香草酚蓝16ml，Andrade指示剂20ml（蒸馏水100ml，酸性复红0.5g，lmol/1NaOHl6m1），即为基础液。其中加入甲液、乙液各20ml即为该培养基。现有干粉培养基供应市场。
[附]甲液：硫代硫酸钠34g，枸橼酸铁铵4g，加水至l00ml，煮沸灭菌。
乙液：去氧胆酸钠10g，加水至l00ml，煮沸灭菌。
用途：分离培养肠道致病菌用。
1.7四硫磺盐培养基
基础液：蛋白胨5g
胆盐1g
硫代硫酸钠30g
碳酸钙10g
蒸馏水1000ml
碘液：碘化钾5g
碘6g
蒸馏水20ml
制备方法：将上述基础液各成分混合加热煮沸，可加入1：100敦煌绿水溶液lml，分装试管，每管l0ml，121℃灭菌15min。临用前，加入碘液，每管0.2ml。每100ml培养基中还可加入0.125g碘胺噻唑，以防止变形杆菌的过度生长。
用途：沙门氏菌的增菌培养。
1.8伊红-美蓝培养基（EMB）
成分：蛋白胨10g
乳糖5g
蔗糖5g
磷酸氢二钾2g
琼脂15g
20％伊红水溶液20ml
0.65％美蓝溶液l0ml
蒸馏水1000ml
制备方法：上述成分混合溶解后，调pH至7.2，加入指示剂。121℃灭菌15min后，倾倒平皿备用。已有市售粉剂，加水溶解，灭菌，即可使用。
2.用于支原体分离培养的培养基
2.1分离猪肺支原体的培养基
制备方法：新鲜牛脑心浸汤，加粘蛋白（0.5％），加火鸡血清（15％），加醋酸铊成l：4000，每lml浸汤中加青霉素1000—2000IU（分别灭菌或过滤除菌后混合）。
2.2驴血清培养基
制备方法：25％醋酸铊溶液lmL
青霉素溶液（5万IU/m1）lml
Hank‘S液50ml
牛心消化液30ml
无菌驴血清20ml
水解乳蛋白0.5g
调pH至7.6，按常规消毒灭菌。
2.3Goodwin等氏复合培养基
制备方法：分三步：首先，Hartley消化汤：切碎牛心1500g，水2000ml，加热至80℃时，加入0.8％无水NaHC032500ml，冷至45℃时，加入胰提取液500ml（去脂肪胰脏500g加1500ml水，加酒精500ml，置室温，常摇振，第3天用滤纸过滤），氯仿50ml。混匀后，置37℃6h或45℃3h，之后加浓硫酸40ml，蒸汽加热1h，纱布过滤，用NaOH调pH至8，蒸气加热1h，趁热滤纸过滤，矫正pH至7.6，装瓶高压消毒。其次，灭菌的Hartley消化汤300ml，无菌灭活的猪血清200ml，灭菌的0.5％的水解乳蛋白Hank’S液500ml，灭菌酵母浸液5ml，青霉素加至200IU／lml，醋酸铊加至1.25％，用灭菌的3.5％NaHC03调pH至7.2，无菌分装，以胶塞塞紧。第三，固体培养基：将琼脂溶于Hank‘S液中使成2％，高压灭菌，除青霉素外，其余各物预先放在56℃以下，待琼脂冷至56℃时，各物混合匀，倒平皿（琼脂终浓度为1％）。