制备方法：依次称取各试剂并依次溶解在双蒸水中。以121℃15min高压灭菌甲液和乙液。冷却后，将乙液缓慢加入甲液中并不断搅拌，最终pH7.0。分装于500～1000ml灭菌瓶中。取1～5m1接于T.G中进行无菌检验。贮存于普通冰箱。
B.无钙、镁PBS的配制将上述PBS中的钙盐和镁盐去掉，将其他试剂溶解于蒸馏水中即成。
C.2.5％无钙镁PBS胰蛋白酶溶液的配制
成份：无钙、镁PBS 1000ml，胰酶（1：250）25g。
制备方法：加胰蛋白酶于无钙、镁PBS中，搅拌使其溶解。用赛氏滤器过滤除菌，分装于200～500ml灭菌瓶中。取1～5ml接于T.G培养基中进行无菌检验。贮存于-20C。
5.Versene溶液（0.02％）的配制
成分：NaCl8.0g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO41.15g，乙二胺四醋二钠（EDTA），0.2g，双蒸水1000ml
制备方法：分别称取试剂，并按顺序依次溶解。分装于50ml瓶中。121℃高压灭菌15min。保存于室温。
6.Versene胰蛋白酶溶液的配制
无菌操作。取无钙、镁PBS胰蛋白酶溶液（2.5％）5ml，Versene溶液（0.02％）45ml；充分混合即得。
7.Hank’S平衡盐溶液十贮存液（HBSS，10×）的配制
甲液成分：NaCl 80g，KCl 4.0g，MgS04·7H201.0g，MgCl2·6H201.0g，CaCl21.4g，葡萄糖10g，双蒸水800ml
乙液成分：NaH2PO41.15g，KH2PO40.2g，双蒸水200ml；
制备方法：依照上列顺序称取各试剂，并依次溶解于水中。将甲液和乙液分别于121℃高压灭菌l0min或过滤除菌。冷却后，将乙液缓慢加入甲液中，并持续搅拌。分装于100—500ml灭菌瓶中，盖紧塞子。贮存于室温或4℃。
使用时用灭菌双蒸水稀释，根据需要加入酚红指示剂（终浓度百万分之二十）、青链霉素或用NaHC03调pH到所需值。
8.Earle，s平衡盐溶液
A.贮存液（EBSS，10×）的配制
甲液成分：NaCl 68g，KCl 4.0g，MgS04·7H202.0g，Na2HP04·H2O 1.40g；
乙液成分：CaCl22.0g，双蒸水200ml：
制备方法：依次称取各试剂并依次溶解于双蒸水中。以约121℃15min分别高压灭菌甲液和乙液。冷却后，将乙液加人甲液中并缓慢搅拌。分装于100～500ml灭菌瓶中，盖紧瓶盖。取1～5ml接于T.G培养基中进行无菌检验。贮存于室温或4℃
B.使用液的配制
将EBSS（10×）做10倍稀释，方法同Hank‘s平衡盐溶液使用液的配制。
9.5％水解乳蛋白溶液的配制（LH）
成分：水解乳蛋白50g，双蒸水1000ml：
制备方法：称取水解乳蛋白并溶解于双蒸水中，可通过56℃水浴加热。分装于100～200ml瓶中。121℃高压灭菌10min。取lml接于T.G培养基中进行无菌检验。贮存于4℃或室温。
10.细胞生长液的配制培养液一般不能单独作细胞培养用，应根据需要和说明书上的规定，加入适当比例的小牛血清或胎牛血清、双抗和酚红等，并用NaHCO3调节pH值。有的还要求加入谷氨酰胺。
下面是两种常用的细胞生长液配方：
细胞生长液Ⅰ：主要用于鸡胚成纤维细胞和原代肾细胞的培养。
成分：灭菌双蒸水72.5ml，水解乳蛋白溶液（5％）10.0ml，Earle，sl0×（或Hank，s 10×）9.5ml，犊牛血清5.0ml，青霉素1.0ml，链霉素0.5ml NaHCO3（7.5％）1.0ml，总量100ml；
细胞生长液Ⅱ：细胞生长液Ⅱ应用范围很广，但不同细胞对血清的含量要求会有不同。如鸡胚成纤维细胞、BHK21等细胞的培养要求5％的血清含量；IB-RS-2等细胞的培养要求10％的血清含量；鸭胚肝细胞等的培养要求20％的血清含量；胎驴原代细胞和皮肤原代细胞的培养要求30％的血清含量。当上述配方中血清含量变化时，则相应调整其他溶液的量，抗生素和NaHCO3的含量不变。
成分：灭菌双蒸水33.5ml，水解乳蛋白溶液（5％）4.5ml，Earle，s 10×（或Hank，s 10×）4.5ml，199培养基（或E-MEM培养基）45.0ml，犊牛血清10.0ml，青霉素1.0ml，链霉素0.5ml，NaHC03（7.5％）1.0ml，总量l00ml。
11.细胞维持液的配制将上述细胞生长液中的血清含量降为1％～2％，其他成分做相应的调整即为细胞维持液。但有的细胞维持液血清含量仍然要达到15％～20％（如胎驴原代细胞和皮肤原代细胞等）。传代细胞的维持液常常可以不加血清。
12.水产动物细胞生长液用Earle，s盐溶液配制的D-MEM、L-15、L-100培养基5％～20％的胎牛或犊牛血清（初代培养血清用量为10％～20％，继代培养血清用量为5％～10％）。不同动物细胞应注意渗透压的调整。
水产动物细胞生长液渗透压的调整：由于水产动物种类繁杂，其细胞渗透压有一定差异，所以作为哺乳动物细胞培养用的E-MEM在用于水产动物细胞培养时，有时需要做一定的调整。
13.水产动物细胞维持液的配制降低水产动物细胞生长液中血清含量至1％～2％，生长液中其他含量做相应的增加。水产动物细胞消化液也用Versene胰蛋白酶溶液。因作用时间短，可不必调渗透压。
14.细胞计数用结晶紫溶液的配制
成分：结晶紫1.0g，柠檬酸19.2g，蒸馏水1000ml；
制备方法：先将柠檬酸溶解在蒸馏水中，然后加结晶紫，待完全溶解后贮存于室温。
15.硫乙醇酸盐（T.G）培养基的配制
成分：酪胨15.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖5.0g，硫乙醇酸钠0.5g，
L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂粉0.5g，NaCl 2.5g，0.2％美蓝溶液0.5ml，蒸馏水1000ml；
制备方法：称取上述各试剂，边搅拌边加于500ml蒸馏水中。溶解后，补足蒸馏水至1000ml。摇匀后，分装于试管中，每5m1分1支试管。高压灭菌，121℃15min。避光保存于室温。
16.细胞培养基（D-MEM、199、L-15、L-100等）D-MEM是目前广泛应用的培养基之一，基中含多种氨基酸、维生素以及一些有机物质和无机物质。市场上有成品D-MEM出售，无需自己配制。199、L-15、L-100细胞培养基也是目前广泛应用的培养基，与D-MEM在成分上有一定差别，也以使用成品为佳。成品培养基出厂前经过了物理检验、化学检验、稳定性检验、微生物检验、内毒素检验、细胞毒性试验和细胞生长试验，因而质量稳定可靠。使用成品可以提高工作质量和效率。目前市场上出售的培养基既有液体的，也有干粉的。干粉培养基更利于保藏和运输，使用时只需按说明书加入双蒸水，溶液过滤除菌后即可使用。
不同产品批号的培养液成分略有不同，培养液有含Hank’S和Earle‘S两种。其区别在于前者氯化钠为0.85％而后者为0.65％，渗透压有所不同，应根据培养的细胞对象选择购买。干粉培养基可保存于-20℃，液体D-MEM应贮存于2～8℃。
二、动物细胞培养方法
1.原代肾细胞培养
1.1以无菌术采取新屠宰的动物肾脏，置于灭菌平皿中。
1.2用无菌剪刀、镊子去除被膜、结缔组织和血块；将肾从中剪成两半，去除髓质；用Hank，s平衡盐溶液冲洗二次后转移至灭菌小烧杯中；将肾皮质剪碎（约1mm3）；用Hank，S平衡盐溶液洗二次去除血液。
1.3加约25ml预温的（37℃）Versene胰蛋白酶溶液（0.25％），通过磁力搅拌5min。弃掉第一次消化下来的细胞，加25～30ml新预温的Versene胰蛋白酶溶液，继续磁力搅拌15min。
1.4将细胞悬液通过2层纱布过滤，将滤液收集于含10ml细胞生长液的200ml离心管中，置于洗浴中或普通冰箱中。未消化好的组织块按上述方法再次重复消化，直至全部消化过滤完
1.5将几次消化收集的细胞悬液在4℃下以1000r/min离心10min，弃掉上清液，立即加入细胞生长液。每支离心管加30～50ml细胞生长液悬浮细胞沉淀。
1.6将细胞悬液转入50ml刻度离心管，以1000r/min离心10min，弃掉上清液；用细胞生长液重悬细胞沉淀，然后补加细胞生长液至适当的浓度。一般以l：200～1：400稀释为宜，主要取决于细胞来源于何种动物的肾脏
1.7将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶（板、管中），于37℃培养箱中培养。
如果需要细胞计数，可按下述方法进行：取上述第五步制成的细胞悬液0.5ml，加入lml结晶紫溶液，混匀后加到血细胞计数板上。计数板上有2个计数室，计数每个计数室中的5个计数池（即计数4个角和中间计数池中的细胞），这样共需计数10个计数池。每个计数池体积为0.1mm3，10个计数池体积共为lmm3，即可容纳1ul细胞悬液。也就是说，10个计数池所计数的细胞即为1ul细胞悬液中的细胞计数。由于结晶紫溶液的加入使细胞悬液稀释了3倍，所以实际lug细胞悬液的细胞数量应乘3倍。lml细胞悬液的细胞数量：M×3×103，其中M为10个计数池中的细胞数量。
细胞培养：用细胞生长液稀释细胞悬液至每毫升3×100个细胞，进行细胞单层培养。
2.原代鸡胚成纤维细胞的培养
2.1选择9～10日龄鸡胚（或12～14日龄鸭胚），用70％酒精消毒外壳。
2.2从气室端打开卵壳，取出鸡胚，去头、脚和内脏，将躯干置于一灭菌小烧杯中，用预冷的Hank，s平衡盐溶液冲洗，用灭菌剪刀剪碎。
2.3用预冷的Hank，s平衡盐溶液充分冲洗组织碎块以尽可能地去除血液；用37℃预温的Versene胰蛋白酶溶液冲洗一次；再加20～50ml同样的Versene胰蛋白酶溶液，通过磁力搅拌，于37℃消化15min。
2.4通过2层纱布过滤细胞悬液，将滤液收集于灭菌离心管中，以1000r/min离心l0min，去掉上清，用预冷的Hank，s平衡盐溶液通过同样洗涤2次。
2.5去掉上清液，加细胞生长液制成10％的悬液（1m1细胞沉淀加9ml细胞生长液），于4℃可保存3—4d；用细胞生长液再作1：40的稀释（终浓度1：400），然后分装到培养瓶中，于37℃.培养48h即做细胞培养用。
3.传代细胞BHK21的培养
3.1培养2～3d，选择生长良好的BHK21细胞单层。
3.2弃掉培养液，加入Versne胰蛋白酶溶液，以刚能浸没细胞单层为宜。
3.3室温下培育30～60s，或发现细胞层不透明、发白，开始卷边为止。
3.4轻轻翻转细胞瓶使细胞面在上，在脱离胰蛋白酶溶液的情况下于37℃再培养2～3min。
3.5倾出胰蛋白酶溶液，加入细胞生长液，其量为原细胞生长液的4倍，即细胞做4倍稀释。细胞生长液中使用小牛血清，其含量以5％～10％为宜。
3.6轻轻拍打细胞培养瓶，使细胞分散。
3.7分装细胞瓶（板、管），于37℃培育。应在48h内长成单层供使用。
4其他传代细胞的培养其他传代细胞的传代培养与BHK21细胞基本相同。不同细胞需要的生长时间、胰蛋白酶溶液的浓度及消化细胞的时间可能会有不同，传代时稀释的倍数也不同，通常在1：2～1：8之间。细胞生长液的不同主要是对其中的血清要求和用量不同，有的用小牛血清，有的则需要用胎牛血清。血清用量一般为5％～15％。由于商品血清质量差距较大，所以实验者应有自己的经验。
5继代细胞培养
5.1倾出培养瓶中原有的细胞生长液，加入无钙、镁的PBS冲洗一次细胞表面。
5.2加入Versene胰蛋白酶溶液，室温下不时摇动细胞瓶，直至细胞层发白、卷边，即将脱落。
5.3倾出消化液，轻拍培养瓶，摇散细胞，再加入细胞生长液，并进一步摇散细胞。
5.4根据细胞生长情况，按l：2或1：8分装培养瓶，培养于适宜温度，应于36h内长成单层。