再醛化（双醛化法）：在第二步用生理盐水洗涤单醛化的红细胞后，将红细胞用0.15mol/L的pH7.2的PBS液配成4％的悬液，再用丙酮醛（最终浓度1.6％）作第二次醛化，4℃固定17h，不断摇晃，洗涤后配成4％的红细胞悬液，加入1：10000（最终浓度）NaN3，4℃保存备用。
1.4鞣酸处理红细胞：为了进一步提高间接血凝敏感性，经醛化后的红细胞必须再经鞣酸处理，因为鞣酸本身也是一种血凝素，高浓度时会使红细胞凝集，低浓度时使红细胞处于稳定状态，故经适当浓度的鞣酸处理后，致敏的红细胞能使实验的敏感性大大提高，其操作如下：称取适量优质鞣酸用pH7.2的PBS液配成1：20000的溶液，须现用现配；将4℃保存的醛化红细胞，用生理盐水洗2～3次，并用生理盐水配成2.5％的红细胞悬液，与等量的1：20000的鞣酸混合，置于37℃水浴10～15min，取出用pH7.2的PBS液洗1次，再用pH7.2的PBS液配成2.5％的红细胞悬液。
1.5鞣酸化红细胞的致敏：将抗原（或抗体）结合或吸附于红细胞表面称为致敏，已结合或吸附抗原（或抗体）的红细胞称为致敏红细胞。致敏物质可为糖类或蛋白质。多糖抗原比较容易致敏，可吸附于未经处理的红细胞表面。而蛋白质抗原或抗体需要有别的成分参与方能致敏红细胞，如常用的鞣酸法、联苯胺法、金属离子法等。
致敏红细胞的最适抗原或抗体用量的测定：致敏红细胞的抗原或抗体的用量过低就不能得到凝集的最高效价，而过高亦不能再提高凝集反应的敏感性，因此在正式试验之前都必须测试致敏用的抗原抗体的最适用量。方法是将抗原或抗体作倍比稀释，分别致敏红细胞后，再与相应的抗血清或抗原作血凝反应，出现最高血凝效价的最少抗原（或抗体）称为一个致敏单位，正式实验使用两个致敏单位即可。
致敏方法：取两个单位的致敏抗原（或抗体）lml，加pH7.2的PBS液4ml，再与2.5％鞣化红细胞混合均匀后于37℃作用30min，经2000r/min离心5min，沉淀的红细胞用含有1％已灭能的健康兔血清的pH7.2的PBS液配成2％的致敏红细胞悬液，一般病毒抗原致敏的红细胞应立即使用，4℃保存也不超过48h，为了延长致敏红细胞的保存期，将洗涤后的致敏红细胞用含4％健康兔血清的PBS pH7.2液配成10％的致敏悬液加0.01％的硫柳汞摇匀，分装于灭菌的安瓿，1支lml，低温真空干燥，冻干以后的致敏红细胞其凝集效价不变，亦无自凝现象，在4～6℃可保存6个月，冻干致敏红细胞使用时，每支加pH7.2的PBS液5ml摇匀后使用。
1.6兔血清稀释液：取5～7只健康的成年家兔，心脏采血，分离血清，所得各血清经检查无菌后混合，56℃灭能30min，分装后置-20℃保存，可长期使用，使用时以pH7.2的PBS稀释液配成1％的兔血清。现用现配。
1.7受检血清：按常规方法采集、分离的血清，经56℃灭能30min备用。
2.间接血凝试验方法
2.1取洁净的96孔V型血凝反应板，在其长端顺序编号，每一检验样品用两排，每排8孔，用连续加液器，每孔加入含1％兔血清的pH7.2的PBS稀释液25ul。取25ul被检血清，加人第一孔内混合后；用微量自动稀释器或稀释棒，插入第1孔内，充分稀释后蘸取25ul移至第2孔，充分稀释后蘸取25ul至第3孔，依次倍比稀释至第7孔，混合后弃掉25ul，最后1孔不加检样为空白对照，每一检样按同法稀释两排。每一检样的第1排孔滴加1％的致敏红细胞悬液25ul；为测定排，第二排各孔滴加1％未致敏红细胞各25ul，为对照排。置微型振荡器上振荡混合2min，再置室温2h，待空白对照孔红细胞全部沉于孔底，即可判定结果。
2.2结果判定：判定标准如下：
#：100％红细胞凝集，凝集颗粒均匀地分布在整个孔底，呈薄状。
+++：75％红细胞凝集，孔底形成环状，周围有凝集颗粒，但不成膜状。
++：50％红细胞凝集，孔底中心有少量红细胞沉积，周围有不均匀的分散红细胞。
+：25％红细胞凝集，红细胞大部沉积于孔底中心，周围有少量分散红细胞。
-：为不凝集，红细胞完全沉积于孔底中心，呈小圆点状。
以凝集++或以上的最大稀释倍数为该检样的血凝价。
血凝价在80×以上，测定排比对照提高两个滴度以上，判为阳性，只高出一个滴度判为疑似，两排滴度相同判为阴性。
3.反向间接血凝试验方法
其操作和判定与间接血凝试验一样，反向间接血凝试验仅仅是用抗体致敏红细胞来检测组织悬液或细胞培养液中的抗原。
4.注意事项每次试验时，应设标准阳性血清和阴性血清各两排作为对照。操作过程应避免产生气泡，如遇有气泡可用烧热针头烫掉。试验用的红细胞悬液不能冰冻保存，以免出现自凝。每一检样用一只滴管，不可交叉使用。
四、乳胶凝集试验
聚苯乙烯乳胶是大小一致的球形小颗粒，乳胶微球直径约0.8um。在偏碱条件下，呈稳定的白色悬浮液—乳胶。乳胶颗粒对蛋白质、核酸等高分子物质具有良好的吸咐性能。利用乳胶的微球作载体，以吸附某些抗原或抗体，即可用于检测相应的抗体或抗原，称为乳胶凝集反应。本法具有简便、快速、保存方便、比较准确等优点。在血清学诊断中已用于钩端螺旋体病、囊虫病、沙门氏菌病、妊娠诊断以及激素等的检测。
聚苯乙烯乳胶既有商品出售，也可自行合成，用以吸附抗原时，可以pH8.2的甘氨酸缓冲液将其制成1％乳胶，逐滴加入适当稀释的抗原液，充分混合后，置37℃30min，离心洗涤，恢复至原来1％乳胶体积。也可用以吸附抗体，制备乳胶血清。即在0.4％乳胶液25ml中，逐滴加入稀释一定倍数的抗血清1～7ml，边加边摇，当出现微颗粒时继续滴加，直至颗粒消失为止。吸附致敏后的乳胶液加入硫柳汞防腐剂至0.01％，置4℃下可保存数月至1年。乳胶液切忌冻结。
乳胶凝集反应常采用玻片法，也可用试管法。现以检测沙门氏菌抗原的乳胶凝集反应玻片法为例叙述其操作程序。
1.材料准备
1.1器材与试剂：玻板或玻片、滴管和吸管等器材；沙门氏菌A-F多价血清或各群单价血清；商品的聚苯乙烯乳胶；硼酸缓冲液（甲液：硼酸12.37g加水至1000ml；乙液：硼砂19.07g加水至1000ml，二液配好后分别高压灭菌，用时取甲液65ml加乙液35ml即成，pH8.4～8.6）。
1.2乳胶致敏：乳胶1ml加蒸馏水4ml，再加硼酸缓冲液20ml，即成25倍稀释的乳胶，滴加用生理盐水1：20稀释的沙门氏菌诊断血清1—2ml，边加边摇，至出现微细颗粒后，继续滴加直至颗粒消失为止。致敏乳胶应符合下列条件方可使用（a与生理盐水不出现自凝；b与相应抗原菌株出现阳性凝集；c与其他无共同抗原的菌株不出现凝集）。
1.3待检增菌培养物的制备：将待检样品接种于沙门氏菌增菌培养基上37℃培养24h，即可获得。
2.试验方法和结果判定取洁净玻板或玻片，用蜡笔划成方格，记录检样编号。滴增菌培养物2～3滴于玻板的方孔内，然后于其上滴加致敏乳胶1滴，用牙签混合后轻轻摇动。于3～5min出现明显凝集颗粒者为阳性反应，根据其反应凝集程度以++++、+++、++、+和-记录反应结果。
五、协同凝集试验
葡萄球菌A蛋白（Staphylococalprotein A，简称SPA）是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质成分，参与多种哺乳动物IgG分子的FC片结合。SPA与IgG结合后仍保持其抗体活性。当此被覆着特异性抗体的葡萄球菌与相应的抗原结合时，就可互相联结引起协同凝集反应（简称COAG）。本法已广泛应用于快速检测多种细菌、病毒等颗粒抗原以及可溶性抗原。
用于COAG的标准菌株有Cowan 1株和国内选育的1800株，以及对照的，不含A蛋白的Z12、wood 46株等。
COAG通常用玻板法，数分钟内即可判定结果。以猪败血链球菌为例，其检测方法如下：
1.材料准备
1.1器材与试剂：器材同乳胶凝集试验，试验用稀释液为0.1M pH7.2PBS按常规法配制。
1.2SPA菌液的制备：以标准菌株Cowan 1株或国内选育的1800株葡萄球菌接种于葡萄糖营养琼脂培养18-24h，用PBS洗下菌落，洗涤2次，加0.5％甲醛PBS制成10％（V/V）菌悬液，置室温3h，离心去上清，用PBS洗2次，积压菌体恢复10％浓度，并加叠氮钠至0.1％浓度。此即SPA菌液，于4℃下可保存数月。
1.3SPA菌液的致敏：取上述SPA菌液lml，以PBS洗涤2次，将沉淀恢复至lml，加入猪败血链球菌抗血清0.1ml，充分混合后，置37℃水浴30min，不时轻轻振动，使抗体与SPA充分结合，离心去上清，再用PBS洗2次，沉淀用含有0.1％叠氮钠的PBS制成1％SPA致敏菌液。
1.4待检菌液：将猪败血链球菌接种于血清肉汤中，37℃培养过夜即得；另外接种1支猪丹毒杆菌作对照用。
1.5试验方法与结果判定：取洁净玻片用蜡笔划成3格，第一格加猪败血链球菌液体培养物1滴，第二格加猪丹毒培养物1滴，第三格加空白培养基1滴，然后各加入致敏SPA菌液1滴，混合后，在0.5min之内即出现明显凝集者（++++或+++）为阳性，凝集颗粒小者（++）为可疑，液体混浊（+、-）为阴性。
第二节沉淀类试验
沉淀类实验包括琼脂凝胶免疫扩散试验、环状沉淀试验和絮状沉淀试验等。琼脂凝胶免疫扩散试验是一种比较经典而适用且方便的方法。琼脂或琼脂糖是一种含有硫酸基的多糖，高温时能溶于水，冷后凝成凝胶，内部形成一种多孔的网状结构，而且孔径很大，可允许大分子物质（分子可达百万以上）自由通过。孔径的大小还决定于琼脂浓度，琼脂浓度大，孔径相对较小，琼脂浓度小，孔径相对较大。1％琼脂凝胶的孔径约为85nm，由于琼脂或琼脂糖具有很好的化学稳定性，制成凝胶后含水量大，透明度好，来源方便，易处理，因此是一种很好的扩散介质。抗原和抗体的分子量一般都在20万以下，在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时所受的阻力很小，基本上呈自由扩散形式。由于不同抗原分子的分子量、结构、形状和电荷量不同，因此其扩散系数不同，在凝胶中的扩散速度也就不同。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物，若两者在相遇处比例适当。由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而产生沉淀，呈现出线状或带状，这样的沉淀就形成了一个“特异性屏障”，凡在免疫学上与其相同的抗原或抗体分子不能通过，而性质不同的那些分子可以通过这个屏障而继续扩散，直到形成它们自己的复合物为止。这样，不同抗原所形成的沉淀各有各的位置，从而有可能将混合物分离开来，进行比较研究。这种反应称为琼脂凝胶免疫扩散，或琼脂扩散。
一、琼脂凝胶免疫扩散试验
琼脂凝胶免疫扩散试验（或称免疫扩散），其形成的线状带具有特异性和交叉性。抗原能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质。抗原分子表面具有特殊构型的、有免疫活性的化学基团，称为抗原决定簇。抗体是在抗原刺激下产生，并能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。一个抗体分子上有两个可变区，可变区决定了每种抗原决定簇均有其对应的一种抗体。抗血清是针对不同抗原决定簇的抗体混合物，一般从免疫动物的血清获得，因此称抗血清。
抗原决定簇与其对应的抗体结合，形成抗原抗体复合物，这是一个一对一的反应过程。具有高度的特异性。所有血清反应都是以此为基础的，因此具有高度的特异性。琼脂凝胶免疫扩散试验也不例外，同样具有高度特异性。一种抗原往往具有多种抗原决定簇。不同抗原可能存在相同的抗原决定簇。同一种抗体分子与不同抗原中存在的与该种抗体相对应的相同抗原决定簇之间的反应就是血清学反应中的交叉反应。应当注意，这种交叉反应也是特异性的，而且是血清学反应所固有的。琼脂扩散试验同样也存在一定的交叉反应。因此，琼脂扩散试验的特异性还依赖于抗原或抗体的纯度。提供具有高纯度的高特异性的抗原或抗血清，对琼脂扩散试验的特异性是至关重要的。可使用单克隆抗体以提高反应特异性。有时抗体分子与抗原决定簇的结合反应并不总是一对一的，抗体分子有时会与不对应的、但在化学结构上极其相似的抗原决定簇结合，这就是非特异性反应。非特异性反应的产生并不总是由于抗体对抗原决定簇的识别错误所引起，与反应有关的其他因素，如离子强度、pH等也会造成非特异性反应的产生。