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第4章 常用器械及仪器设备(3)

1.15.补色器插板的插口(slot for auxiliary objects)这是当作微分干涉相衬观察和偏光需加入的各种补色器预留的插口。

1.16.双目镜筒或带照像镜筒的双目镜筒(binocular tubes or binocular phototubes)用来安放目镜及照像装置。为便于观察,镜筒制作成具有一定倾斜角度(30。或45。),设有瞳距调节装置,可在55。—75。范围内调节,以适合不同使用者两眼瞳孔距离。双目镜筒内装有一些折光和分光棱镜,能把从物镜出来的一束成像光束等分成两部分,分别由两个目镜作观察。带照像镜筒的双目镜筒一般在右侧装有光束分配棱镜的拉杆,把它全部推入时只作观察,拉出来则一边观察一边照像,或全部作显微照像。

1.17.目镜(eyepieces)目镜是显微镜中把物镜所成的像作再一次放大的光学部件,显微镜的总放大倍数通常就是物镜与目镜放大倍数的乘积。为方便不同视力者进行显微拍照时调焦同样清晰,一些目镜设计成可调焦式。为了使显微镜获得最大有效放大倍数和最高分辨本领,必须合理选配目镜。到目前为止,由于受光学定律的制约,光学显微镜最大的有效放大倍数为1250—1300倍。10×目镜是最常用而必须配备的目镜,观察荧光时最好选用10×以下的目镜。

2.显微镜的正确调试和使用在了解了显微镜各主要部件的名称、构造和功能之后,为了更好地发挥显微镜的各种功能,提高工作效率,保证在显微观察及显微照像过程中取得最佳效果,使用人员必须了解和掌握显微镜正确的调试方法和使用方法。尤其在新一代显微镜中,具备了多种功能,能进行多种显微镜检方法观察,正确的试调方法和使用方法就显得尤为重要。下面以Axioplan万能研究显微镜为例,简述调试及使用方法。

2.1显微镜照明光路系统的调整为了使显微镜的视野能受到均匀而又充分的照明,在显微镜初次安装和调试时,就必须把照明光路系统调整好,这是正确使用显微镜,并获得正确、可靠结果的重要手段和最基本的要求。此外,正确掌握照明光路系统的调整,是使用显微镜过程中更换光源灯泡后所必经的步骤,也是在日常使用过程中不时地检验显微镜性能的必要手段。显微镜照明光路系统的调整主要有以下4项内容:

2.1.1照明光源灯室在显微外的初步调整:①首先将灯室的外壳打开,压弹簧夹子将卤素灯泡装入插座中,安装时避免手指直接接触灯泡(可用柔软的布或纸隔住),以免灯泡上留有指纹等脏物,影响灯泡的使用寿命。②把灯室摆在桌面上,接通电源后,用专用的螺丝刀调节灯的调焦旋钮孔(标有“←→”),使灯丝投影在1—2m外的墙上,将灯丝成像调至清晰;然后调节灯的高低位置调节螺丝孔(标有“—”),使灯丝位置高低适当;再调节灯的左右位置调节螺丝孔(标有“—”),使灯丝左右位置合适。

2.1.2光源发光体(灯丝)在显微镜内位置的检验和校正:目的是为了把发光体的像端端正正地调入物镜的视域范围内,从光源的角度去确保显微镜的视域受到充分而均匀的照明,这是调整库勒照明系统的前提条件。

需要的基本工具:对中望远镜购置显微镜时已配备。①拔掉灯库内的毛玻璃套筒,把灯室装回显微镜上;②选用10×物镜,开亮光源找样品并调焦清晰,再换用40×物镜把样品调焦清晰(40×物镜可以看清灯丝的全貌);③把聚光镜的孔径光阑和视场光阑均开到最大;④拔掉其中一个目镜,换上对中望远镜,抓住白色部分,另一手伸缩黑色接目镜,就可在视野中看到灯丝像;⑤如灯丝位置不合适,调“—”孔,把灯丝像沿水平方向调好,调“—”孔,把丝像沿垂直方向调好,直至将灯丝像调至刚好充满物镜孔径的光圆像;⑥调整完毕后,将毛玻璃套筒插回原位,拔掉对中望远镜,换回目镜作下一步调整。

以上所述照明光源灯室在显微镜外的调整和光源发光体在显微镜内位置的校验,只需在显微镜初次安装调试及更换灯泡时进行,平时使用显微镜时不能随意乱调乱动。万一调乱时,可按上述步骤调回原状。

2.1.3库勒照明(Kohler)系统的正确调整:显微镜的正确调试,主要工作之一是照明光路系统的调整,而其中的关键是库勒照明系统的调整。对于每一位使用显微镜的人员,特别是作显微照像的人员来说,应该对库勒照明系统的原理及其调整步骤有一定的了解和掌握,才能充分发挥显微镜应有的功能,拍出来的照片才能在效果上比较一致而又完善。

库勒照明系统的原理简单来说就是:光源发光体上任意一点发出的光,可以照明显微镜的视域范围,而光源发光体上每一点所发出的光汇集起来,在显微镜的视域中就实现了非常充分而又均匀的照明。

调整库勒照明系统的目的,是为了使所观察的视域能获得均匀而又充分的照明,防止杂散光对照像系统造成影响或干扰,以免照像时在底片形成灰雾。调整库勒照明系统的必要部件:视场光阑、可进行合轴调整的聚光镜系统。

①选用10×物镜和10×目镜;②把聚光镜前端透镜摆进光路中,孔径光阑调至适中的位置上(不大不小),再把聚光镜升到最顶的位置上,聚光镜转盘调至明视野“J”位置;③把视场光阑调至最小(0.1);④载物台上放上已封片的生物样品,开亮光源,调焦清晰;⑤视域中会出现一个局部照明的区域或亮斑,这是视场光阑的模糊像,在其中可以清晰地看到样品的细节;在它之外是较暗的视域,不一定能把样品的细节看得清楚;⑥把聚光镜微微地向下调,使视野中的亮斑逐渐收小,慢慢变成一个清晰的多边形象,这便是视场光阑的清晰像;⑦一般情况下,多边形象并不在视域中央,需要调整聚光镜的一对调中螺丝,把视场光阑多边形的像调至中央位置;⑧逐渐开大视场光阑,使多边形象成为视域的内接多边形,进一步核对调中的状况,如对中不够理想,继续微微调对中螺丝;⑨将视场光阑稍为再微微开大一些,使它的多边形象恰好消失在视域的边缘上,至此,库勒照明系统调整完毕。

库勒照明系统调整好以后,整个视域照明均匀,拍摄的显微照片明亮清晰,反差正常。在日后使用过程中应特别注意:①视场光阑不可任意开大,但可随物镜倍数的增大而将视场光阑收小,随物镜倍数的减小而开大;②聚光镜的高低位置不准乱调,否则会破坏已调整好的库勒照明系统;③使用10×以下物镜时要将聚光镜前端透镜摆出光路外,使用10×或10×以上物镜时要将前端透镜摆入光路中;④关于物镜倍数与视场光阑大小配合问题,在实际使用过程中,作为一般观察不一定要收小或开大视场光阑,但作显微照相时,为了避免杂散光线对照相系统的干扰,以便能拍摄到较完善的照片,则应在使用每一个倍数的物镜时,把视场光阑调节到正好消失于所观察的视域边上,这是比较繁杂的工作,但又非做不可。较为简便的方法是把与各个倍数物镜相对应的视场光阑事先调整好,并作好记号,以后使用时根据记号直接调至相应的位置。

2.1.4孔径光阑的正确使用:由于聚光镜的孔径光阑可以影响显微镜的分辨率,使用时应掌握正确的使用方法。过去由于对孔径光阑的认识不足,往往把它当作是调节视野亮度的工具。虽然调节孔径光阑在一定程度上可以改变视野的亮度,但会直接影响成像的反差、对比度及分辨率,在使用过程中应尽可能避免。

为了发挥聚光镜孔径光阑的作用,以便在观察时,尤其在作显微照相时获得最佳分辨率,在每换用一个倍数的物镜时,在样品调焦清晰后,需要调节孔径光阑,使它的大小正好等于所用物镜数值孔径(物镜孔径像)的2/3。

调整方法是用对中望远镜对焦于视野中黑色相差环上,调节孔径光阑,可以看到一个多边形的孔径光阑像,然后调到等于物镜孔径像的2/3,即介于黑色相差环外与圆形视域内之间。为方便起见,可把与各倍数物镜相对应的孔径光阑预先调整好,并作好标记,以免每次使用都要重新调整。

2.2.显微镜成像光路系统的调整及显微镜检术概要显微镜成像光路系统的调整,是根据不同显微镜检术的需要而进行的。所谓显微镜检术(microscopy),概括而言就是以显微镜观察样品时所使用的照明方式,以及如何使样品所成的像能获得更良好反差的技术与方法。以下简述显微镜检术中已成熟的几种方法及对应的显微镜成像光路系统的调整方法。

2.2.1透射光明视野法(brightfield):这是自显微镜发明以来最传统、最普遍的应用方法。

基本部件:①物镜:任何物镜都可作明视野观察;②聚光镜:各种聚光镜均可,最好配有孔径光阑。

调整方法:在上述显微镜的库勒照明系统调整好后,即可应用明视野法。

适用范围:所有已染色的组织切片、血液涂片等。

注意事项:①使用明视野方法观察时,一定要将库勒照明系统调整好;②视场光阑不可任意开大,使用10×及10×以下和10×以上物镜时,要将聚光镜前端透镜分别摆出和摆进光路中;③不可用聚光镜嗨孔径光阑来调节视野的亮度,更不要乱调聚光镜的高低位置,否则,会降低显微镜的分辨率和破坏已调整好的库勒照明系统;④作显微照相时,每换用一个倍数的物镜,就要调节聚光镜的孔径光阑,使它的大小正好等于所用物镜数值孔径的2/3。

2.2.2透射光相差法(phase-contrast):这是现代显微镜检术中的一种反差增强法。

基本部件:相差物镜、明视野与相差兼用的多用途聚光镜、对中望远镜、绿色滤光片。

调整方法:①在库勒照明系统调整好的基础上,用明视野方法把样品调焦清晰;②把聚光镜转到Ph1对准转盘刻度线位置,选用10×相差物镜,换上待观察的透明样品;③拔掉其中一个目镜,换上对中望远镜,并调焦于视野中的两个相差环上(物镜的黑色相差环和聚光镜的透光相差环);④视野中的两个相差环不一定重合,调节聚光镜上的两个调节装置(调整相差环左右位置的调节杆和调整前后位置的摩擦式转钮),使透光环作前后左右移动而与黑环重合;⑤调整好后,换回观察用目镜,将绿色滤光片按入光路中,即可观察到样品的相差像;⑥用20×和40×物镜观察时,聚光镜应设在Ph2位置上,用100×物镜时,聚光镜应设在Ph3位置上。

适用范围:适用于观察透明、未染色或不能染色的样品,如各种活细胞、活组织、未染色或不染色的组织切片、水生生物等。

2.2.3微分干涉相衬法(differential interference-contrast,DIC):为了克服相差法观察时样品细节像周围伴随有光晕,会掩没掉本来应该看见的细节,以及样品或组织切片厚度要求相当薄,原则上不能厚于10um等局限性,利用双光束干涉的原理设计了微分干涉相衬法。

调整方法:①必须在库勒照明系统已调好的基础上才能调好DIC方法;②选用10×物镜,以明视野先确定好能把样品看清晰的物镜调焦位置;③把起偏器(polarizer)摆入照明光路中,注意其取向应为东一西方向;④把聚光镜转盘转到与10×物镜对应使用的位置上,即DIC0.3—0.4;⑤在物镜后方或物镜转换器上插入10×物镜使用的DIC插片(DIC slider);⑤把检偏器(analyser)插入成像光路中,注意其取向应为南-北方向;⑦换上待观察的透明样品,开亮光源把样品调焦清晰;⑧调节DIC插片,使微分干涉相衬的像达到最佳效果,也就是浮雕效果最为明显;⑨同时可调节聚光镜的孔径光阑,使反差的效果也达到最佳;⑩然后再细微调样品的细节,可见样品中不同层面上的结构;如果把补色器(first order red retardation plate)插入,并同时调节DIC插片,可在视野中看到不断变化的绚丽色彩,红、橙、黄、绿、蓝、紫、粉红、粉紫及金黄色都具有。

适用范围:透明或不能染色的组织切片,厚度可达100um左右,培养中的活组织和活细胞、水生生物等。

2.2.4落射光激发的荧光法(incident-loght fluorescence Epi-FL):简称为落射荧光法,是近代显微镜检术中新发展出来的一种强有力的反差增强法。它将激发荧光用的光源改在物镜的上方,光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品,从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而由目镜观察。该方法较简便,效率高,50W的光源强度比透射荧光法的250W还强。