第13章 病原学、免疫学及生化检测 (3)
（2）间接凝集反应：是将可溶性抗原或抗体吸附于一种与免疫无关的一定大小的微粒上，使成致敏微球，然后与相应的抗体或抗原作用所发生的凝集。微球应用最多的是人O型红细胞及羊红细胞，故又称间接血凝，依据检测抗原抗体的不同可分为正向间接血凝试验、反向间接血凝试验及间接血凝抑制试验。
2.沉淀试验
可溶性抗原与特异性抗体结合，在适量电解质的存在下，形成沉淀物。其反应机理与凝集反应基本相同，不同点是凝集反应的抗原是比较大的颗粒性物质、分子大，沉淀反应是比较小的可溶性物质、分子小；凝集反应的凝集块主要由抗原物质形成，沉淀反应的沉淀物主要由抗体蛋白形成；沉淀反应的试验方法有环状法、絮状法和琼脂扩散法3种基本类型。
3.补体结合试验 是一种在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素为指示系统的抗原抗体反应。
4.免疫荧光技术 是利用抗原抗体能进行特异性结合的免疫反应性，以荧光素标记已知抗体作为试剂，在涂片或组织切片上，以一定的条件使与标本中的抗原呈特异性结合，再借助荧光显微镜观察标本抗原抗体结合物的荧光现象的一种免疫标记技术。免疫荧光法有直接法、间接法和补体法3种。
5.免疫酶技术
是用酶标记抗体或抗原来检测抗原或抗体的方法。可分为免疫酶染色技术与酶免疫测定2大类。免疫酶测定试验包括间接法、双抗体夹心法和竞争法。
（1）间接法：吸附于载体的抗原与第一抗体反应后，再加酶标记第二抗体，然后加酶的底物显色。
（2）双抗体夹心法：是检测抗原的方法，将抗体包被于载体，然后加入待测抗原，使抗原和抗体形成复合物。洗除多余的抗原，再加入酶标记的特异性抗体，反应后漂洗，加入酶底物，颜色的改变与待测样品中的抗原量成正比。
（3）竞争法：利用酶标记抗原和未标记抗原共同竞争有限量抗体的原理，测定样品中的抗原。操作时需要有只加酶标记抗原的系统作为对照。将抗体吸附于载体，反应后漂洗，加入待检抗原样品和酶标记抗原。对照则只加酶标记抗原。反应后漂洗加入酶底物。含酶标记抗原的对照系统出现颜色反应。而在待检系统中，由于样品中未标记抗原的竞争作用，相应抑制颜色反应。待检抗原含量高时，其对抗体的竞争能力强，所形成的不带酶的抗原抗体复合物量亦多，带酶复合物的形成量相对减少，从而使酶催化底物时产生有色产物的量也减少，而带酶复合物量却相对增多，酶催化底物时产生有色产物的量也增多。因此，待检系统中颜色变化的程度与其中抗原的含量成反比。
（二）基本知识
1.抗原
是一类刺激机体引起免疫反应，产生抗体和（或）致敏淋巴细胞，并能在体内外与其相应的抗体（或）致敏淋巴细胞发生特异性结合反应的物质。它具有两种性质，即免疫原性和反应原性。
（1）免疫原性：是指抗原能刺激机体的免疫系统发生免疫反应，产生抗体和（或）致敏淋巴细胞的性质。例如伤寒杆菌进入机体后，能激发产生抗伤寒杆菌的抗体和致敏淋巴细胞。
（2）反应原性：是指抗原与相应的抗体或致敏淋巴细胞在体内外发生特异性结合反应的性质。例如伤寒杆菌在一定条件下，与抗伤寒杆菌的抗体结合，出现凝集。根据这一特点，可利用已知抗原或抗体来检测未知的抗体或抗原。
（3）构成抗原的基本条件
①异物性。抗原必须是非己的异种或异体物质。
②一定的理化性。分子量越大，抗原性越强；要有一定的化学组成和结构，必需的化学基团应暴露在分子表面；聚合状态的蛋白质比单体的抗原性强。
③具有特异性。抗原均有特异性，它只能与相应的抗体或致敏淋巴细胞结合而发生特异性反应。
（4）微生物的抗原物质：表面抗原是包围在细菌细胞壁外面的抗原；菌体抗原存在于菌体，常称为“O”抗原；鞭毛抗原存在于鞭毛中，通常称“H”抗原；菌毛抗原存在于细菌的菌毛中。
2.抗体
是机体在抗原物质刺激下所形成的一类具有与相应抗原发生特异性结合反应的有特定结构的球蛋白。抗体产生的速度与数量，虽因进入机体内的抗原种类不同而异，但也有其共同的基本规律。
3.血清学反应的基本特征
（1）高度特异性：血清学反应的基础是抗原抗体反应在体外的表现，因此它是通过抗原决定簇与抗体的结合部位之间的物理化学特性相对应而互相结合的，故有特异性。
（2）高度敏感性：其中以放射免疫测定的敏感度最高，其次是间接血凝及溶血反应，再次为补体结合反应，较差的是凝集反应和各种沉淀反应。
（3）最适比例：抗原与抗体需有一定的比例时才出现可见反应。
（4）可逆性：抗原与抗体的结合是分子表面的结合，是非共价键的结合。这种结合虽相当牢固，但在一定条件下两者可以解离。
（5）反应过程的二阶段性：第一阶段为抗原与抗体的特异性结合，此阶段需时很短，但无可见现象；第二阶段形成可见反应，此阶段需时较长。
4.影响血清学反应的因素
（1）温度：合适的温度可加快反应。
（2）电解质：可中和抗原及抗体表面上的电荷而降低其电势。
（3）pH：可影响反应物的电离和电荷性质，特别对抗体球蛋白的电离及带电性能影响较大。
（4）振摇和搅拌：能加速反应物的相互碰撞和接触，从而加快形成可见反应的速度。
（三）基本技能
1.直接凝集试验
（1）原理：细菌和红细胞等颗粒性抗原，在有适量电解质存在下，直接与相应抗体结合而出现的凝集现象。
（2）玻片凝集试验
①操作方法：将血清抗体与被测样品在玻片上混匀，倾斜摇动玻片1～3分钟，观察结果。
②结果判定：凡呈现细小或粗大的颗粒为阳性，均匀浑浊为阴性。
（3）试管凝集试验（以肥达反应为例）
①操作方法，取40支试管，分5排放在架子上，并做好标记；另取1支试管加入生理盐水4.75ml及受检血清0.25ml，充分混匀后吸取2.5ml加入上述每排第1管，各0.5ml；余下的2.5ml稀释血清管内加入2.5ml生理盐水，混匀后按第1管的方法加到第2管，以此类推，稀释至第7管；按每排标记符号分别加入诊断菌液，每管0.5ml，混匀放入37℃水浴16～20小时，观察结果。
②结果判定。全部细菌凝集沉于管底，上液澄清，振摇时，可见明显颗粒、薄片或絮状团块，溶液清晰透明；绝大多数细菌凝集沉于管底，上液较混，振摇时，亦可见明显颗粒、薄片或絮状团块；约半数细菌凝集沉于管底，上液较混，振摇时，仍可见颗粒、薄片或絮状团块；＋少数细菌凝集，上液混浊；－阴性反应，混浊度同抗原对照管。
③血清抗体效价，以出现 凝集反应的最大血清稀释倍数的倒数为受检血清抗体的效价。
（4）质量控制
①影响凝集反应的特异性有交叉反应、抗原的自动凝集和干扰抗体等因素。凝集反应有时出现前带现象，是由于抗体的浓度过高所致，也可由血清中的非特异性凝集抗体所引起。
②为使凝集反应的结果具有可重复性，抗原的浓度、稀释剂、温育的时间需相同。监测凝集试验的性能需要阴阳对照血清，标准抗原和参考血清。测定试验的敏感度应有高滴度和临界阳性血清对照。用盐水或缓冲液对照检查抗原是否发生非特异性凝集反应。
2.间接凝集试验
（1）原理：将可溶性抗原或抗体先吸附于与免疫无关的载体上，然后与相应的抗体或抗原作用，在电解质存在的适宜条件下出现凝集反应。
（2）操作方法（以乳胶凝集为例）
①待测血清、阳性血清、阴性血清分别用生理盐水做1∶20稀释，备用。
②在黑色方格反应板上取3个格，用毛细滴管分别加稀释待测血清、阳性血清、阴性血清各一滴，然后每格加入IgG致敏乳胶试剂1滴。
（3）结果判定：混匀后摇动2～3分钟，胶乳颗粒凝集且液体澄清者为阳性反应，不凝集仍保持均匀胶乳状为阴性反应。
（4）质量控制同直接凝集试验。
3.环状沉淀试验
（1）原理：将适量高浓度的已知抗体血清加到小试管的底部，再将等量不同稀释度的抗原沿管壁缓慢加入，重叠于抗体血清上，静置室温或37℃中几分钟至半小时，如果在两液交界面出现白色沉淀环为阳性。
（2）操作方法
①取2支小试管，编号检测管与对照管，用毛细滴管吸取兔抗人血清适量于检测管的底部，对照管加生理盐水。
②沿管壁缓慢加入等量一定稀释度的人血清，使之重叠于抗血清的上面。
③置室温或37℃10～20分钟，观察两液界面有无白色沉淀环，有白色沉淀环者为阳性。
（3）质量控制
①此方法简便，但在加抗原时必须非常小心，要沿管壁缓慢加入，如速度过快，则两液界面不清，影响结果观察。
②抗原与抗血清两液面不能有气泡。
③进行试验时，一般不稀释抗体，而是将抗原做较大倍数稀释，抗体浓度高，检测抗原的敏感性亦高。
④应尽量使用标准试剂，标准品应用国际标准品或国家标准品校准。为避免免疫扩散中抗原稀释，在加抗原前孔中不应有液体，温育时间和温度应恒定一致。当试管沉淀见到前带现象时，应稀释抗原而不是抗血清。
4.絮状沉淀试验
（1）原理：抗原与相应抗体在试管内或玻片上混合，如出现肉眼可见的絮状沉淀物，即为絮状沉淀试验阳性（以诊断梅毒的为例）。
（2）操作方法：配制标准康氏抗原悬液，以一定量生理盐水置于洁净之抗原稀释管内，吸取1ml康氏抗原加入另一康氏抗原稀释管内，将生理盐水迅速倒入抗原管内，不必等待倒尽，立即以包有锡纸的软木塞塞紧管口，静置10分钟后使用。
（3）结果观察与分析：利用天然光线将3管缓缓倾斜，使管内液体流成一薄层，仔细观察有无微细沉淀颗粒存在。颗粒相当粗大，溶液清晰透明；颗粒中等大小，溶液清晰或微混浊； 颗粒细小易见，溶液呈轻度混浊；＋颗粒极细尚可辨认，溶液呈轻度混浊；－肉眼不见颗粒，溶液呈乳白色。
5.琼脂扩散试验
（1）原理：可溶性抗原和相应抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，特异性地结合形成肉眼可见的线状沉淀物的一种免疫血清学技术。琼脂凝胶的含水量极大，常用琼脂凝胶（1％～1.2％）含水98％以上，可使分子量20万以下的大分子物质自由通过。由于大多数抗原和抗体的分子量都在20万以下，所以能在琼脂凝胶中自由扩散。当抗原和抗体相应且比例适当，两者相遇就会出现一条沉淀线。一对抗原和抗体，形成一条沉淀线，故可应用琼脂扩散试验鉴定抗原和抗体成分、抗体的纯度、抗原或抗体的相对效价等。
（2）操作方法：
①抗原及抗体分别加入相应孔中，每孔加入50μl。
②加好的板放入湿盒中加盖后置37℃温箱中24小时观察结果。
（3）结果判定
①强阳性，在被检血清孔与抗原孔之间有明显的沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端互相连接者。
②阳性，在被检血清孔与抗原孔之间有较弱的沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端互相连接者。
③弱阳性，标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端向被检血清孔内侧弯曲者。
④疑似，标准阳性血清孔与抗原孔之间出现的沉淀线末端向被检血清孔内侧偏弯或微弯者。
⑤阴性，被检血清孔与抗原孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性血清的沉淀线向相邻的被检血清孔直伸或向外侧偏弯者，判定为阴性。被检血清孔与抗原孔间出现的沉淀线与标准阳性血清的沉淀线呈现交叉现象时，为非特异反应，判为阴性。
（4）质量控制
①琼脂质量影响试验结果，一般应用精制琼脂粉或琼脂糖配制琼脂凝胶板。
②孔径大、孔距小，较易出现沉淀线，但孔距太小，不易鉴别2条以上的沉淀线，故在病毒抗原分析时，孔距不宜太小。
③一般认为37℃反应比较容易出沉淀线，但对易于失效的病毒抗原，可置室温或4℃反应。
④抗原、抗体的浓度越高，出现沉淀线的时间越快，故必要时，可将抗原、抗体先做适当的浓缩处理。
⑤应尽量使用标准试剂，标准品应用国际标准品或国家标准品校准。为避免免疫扩散中抗原稀释，在加抗原前孔中不应有液体，温育时间和温度应恒定一致。当试管沉淀见到前带现象时，应稀释抗原而不是抗血清。
6.免疫荧光技术（以检测抗核抗体ANA为例）
（1）原理：以小鼠肝细胞或某些培养细胞作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
（2）操作方法
①自冰箱中取出抗原片，用记号笔画圈标记。