公元626年，八月初九，唐高祖李渊退位。李世民继承大统，成为唐朝史上第二位皇帝，太宗皇帝。八月二十一，皇妃长孙氏被李世民册封为皇后。
长孙皇后非常注意自己的行为，即使时间非常仓促，她也让自己的一举一动都遵守礼法。李世民还是秦王的时候，与太子和齐王之间有矛盾。长孙皇后时常入宫，在高祖面前尽孝，恭敬地对待高祖的妃嫔们，以此来弥补高祖与秦王的关系。长孙皇后此举对秦王的帮助很大。
作为皇后，长孙氏生活俭朴。她常常以身作则，对衣物车马之类的物品不提要求，只要够用就行。太宗非常看重她，有时还会和她讨论政务上的赏罚。每到这个时候，长孙皇后就会婉言推辞。她说：“臣妾只是个妇道人家，怎么能随便过问国家大事呢！俗话说得好，‘假如在早上打鸣的是母鸡，那么这户人家很快就会倾家荡产。’”太宗一再征求她的意见，长孙皇后始终不作回答。
长乐公主是皇后的亲生女儿，太宗对她十分的宠爱。长乐公主出嫁时，太宗特意向相关部门下达敕令，要求给公主准备的陪嫁必须是皇姑永嘉长公主的两倍。魏徵就此向太宗皇帝劝谏：“当年，汉明帝在给皇子们分封采邑的时候，曾说过，‘我的儿子怎么能比过先帝的儿子呢？’下令给自己儿子的封地只有楚王、淮阳王封地的一半。现如今长乐公主的嫁妆，竟然是长公主的两倍。您这样做岂不是和汉明帝的做法背道而驰吗？”太宗听后，觉得很有道理，采纳了他的意见。
后来，太宗把魏徵的劝谏告诉了皇后。皇后听后，感慨不已：“以前，臣妾一直弄不清楚，陛下为什么老是称赞魏徵。现在，臣妾明白了。身为臣子，能以礼仪之法阻止君王徇私情。魏徵的确是难得的栋梁之才啊！陛下，我与您是多年的夫妻，您对我恩宠有加。可是每次我与陛下说话，都要注意观察您的脸色，不敢轻易乱说话，害怕冒犯了您。更何况那些朝堂上的大臣呢！他们能对陛下直言进谏，陛下一定要听取他们的建议。”
随后，长孙皇后向太宗请求，派人给魏徵送去四百匹绢和四百缗钱作为赏赐。并转告魏徵：“您的正直我早有耳闻，今日能够亲自领略，实在是名不虚传。今天特意把这些东西赏赐给您。希望您不要改变，继续保持这样忠君为国，直言进谏的心意。”
有一天，太宗罢朝后，提前回到宫中，生气地对皇后说：“这个乡巴佬，气死朕了，以后一定找个机会把他给杀了！”皇后忙问太宗，是谁惹怒了他。太宗说：“是魏徵这个老顽固。他不给朕留一点儿面子，经常在朝堂上羞辱我。”皇后听后，默不做声，退了出去。
过了一会儿，长孙氏换上皇后的朝服，站在院子当中。太宗很奇怪皇后的举动，忙问她这么做的原因。皇后回答道：“臣妾这是在向陛下道贺啊！臣妾曾听说，如果君主开明，那么做臣子的就会很正直。现在，正是因为陛下是开明的君主，魏徵才敢在朝堂上直言说出自己的见解。这难道不是可喜可贺的事情吗？”太宗听后，恍然大悟，平息了怒气。
长孙皇后从小喜欢读书，还经常与太宗交换彼此对历史事件的看法。皇后还会在讨论过程中，提出许多好的建议，并借机出言规劝皇帝。
有一次，太宗心情不好，就把火气撒在宫女身上。皇后看到后，装作自己也非常生气，向太宗请求，由她来处理这件事情。随后，长孙皇后下令，把那名宫女关押起来。等到太宗的心情恢复了，皇后才出面为宫女解释开脱。从那以后，后宫里再没有滥用刑罚的事情出现。
豫章公主出生不久，生母就过世了。皇后把她抱到自己的身边，亲自抚养，当作亲生女儿一样看待。后宫妃嫔中，不论谁生病，长孙皇后都要亲自去看望。她提供自己的药物，让生病的妃嫔服用。后宫之中，没有人不爱戴尊敬长孙皇后。
长孙皇后为太宗生了三个儿子。皇后每次见到几位皇子，都训诫他们：生活要节俭，为人要谦虚。有一次，太子的奶娘，遂安夫人向皇后请求，为太子增加一些日常的用品。皇后回绝了她，说：“作为一国的储君，首先要考虑的是如何树立自己的德行，如何为国家效力。没有必要在日常用度上花费心思！”
李世民得了一种病，很长时间都没有治愈。皇后一直精心照顾太宗，时常昼夜陪伴。太宗患病期间，皇后把毒药放在衣带里，随身携带。她对太宗说：“陛下如果有什么意外，我绝不会一个人独活。”
长孙皇后常年患有气喘病。有一年，太宗带皇后到九成宫巡游。柴绍等人有急事禀报，深夜求见。太宗连忙穿上盔甲，从宫阁里走出来，问询情况。皇后虽然身体不适，但仍然紧随太宗身后。侍臣们纷纷劝皇后休息，皇后说：“皇上现在心神不宁，我又怎么能安心休息呢？”长孙皇后因此病得更重了。
太子看到皇后久病不愈，对她说：“用了那么多药，您的病情也不见好转。我打算请求父皇，大赦天下，让俗人出家，为母后祈福。”
长孙皇后反驳道：“人的生死是早已注定的，不会随人的心意而改变。我从来都没有做过什么坏事。假如积德行善能增添福祉的话，我已经有了。如果不象你说的那样，那么祈福只会给国家带来不好的影响。大赦是国家一项重要的决定，不能随便发布。何况你父皇认为道教、佛教祸国殃民，从来不喜欢在这上面花费精力。怎么能让皇上为了我去做一些他从来都不喜欢做的事呢？如果你执意要这么做的话，不如现在就让我死去！”
看到母亲反对自己的做法，太子没有把此事告诉太宗。后来，私下里，太子和房玄龄交谈，提到了自己和皇后的这番对话。房玄龄把此事回禀了太宗。太宗听后，悲痛不已，决定要大赦天下，祈求皇后能康复。但最终，太宗在皇后执意劝阻下，此事就此作罢。
后来，皇后病危时，房玄龄已经被太宗罢官。诀别时，皇后对高祖说：“陛下，房玄龄跟着您多年，一直尽心尽力。而且，他心思缜密，做事谨慎，从未泄露过朝廷的机密。如果他没有大的过错，您还是让他回到朝堂上，继续侍奉您吧！陛下对我恩宠有加，还赐给我的亲属爵位，让他们得以享受朝廷的俸禄。但是，如果他们自身没有什么才能，恳请陛下不要让他们担任重要的职务，那样会使他们惹上灾祸。陛下只要让他们作为外戚，定时来觐见皇上就好。臣妾生前没有做什么对人有益的事，死后更不要做害人的事。陛下不可以浪费钱财，为我修建陵墓。只要以山为墓，随葬一些瓦木，臣妾就知足了。希望陛下能一如既往地亲君子，远小人。陛下要尽可能的接受臣子们的进言，远离谗言。陛下还要减轻徭役，减少出游和狩猎。这样，即便我死了，也没有任何遗憾了。不用让儿女们再来看我了，见面只会增加伤感，心神不宁。”长孙皇后从衣带中取出一直藏着的毒药，交给太宗。她说：“您生病的时候，我就决定会誓死追随陛下。我绝不做第二个吕后。”
公元636，六月二十一日，长孙皇后在立政殿中去世，谥号文德皇后。
长孙皇后生前，搜集了大量自古以来有关女子得失的故事，整理编写成共三十卷的《女则》。长孙皇后还写过一篇文章。在文中，她针对汉代明德马皇后纵容外戚势力膨胀，进行了批驳。后宫尚仪局的司籍在皇后去世后，把《女则》一书呈现给了太宗。李世民看到此书，悲痛欲绝。他把书交给身边的大臣传看，说：“皇后所著的这本书，完全可以成为流传后世的典籍。朕知道生死由命，也知道不该沉浸在哀伤中。只是朕失去了皇后这样的贤内助，再也无法在后宫中听到那样的规劝，心中始终不能释怀啊！”太宗随后下诏，房玄龄官复原职，重回朝堂。
十一月，太宗命段志玄将军和宇文士及带兵护送长孙皇后的灵柩，出萧章门，前往昭陵安葬。
太宗在为皇后题写的碑文中说道：“皇后生前非常节俭。去世前，要求不让厚葬。皇后认为，盗墓贼的目的就是要盗取墓中的宝物。如果没有宝物的话，盗墓贼自然也得不到什么了。朕非常同意皇后的观点。整个天下都是君王的，不一定非要把东西放入自己的陵墓中，才算是拥有。此次借九山作为皇后的陵墓，由一百多名工匠花费几十天完成。墓中不随葬金银珠宝。随皇后下葬的人俑、车马和器具，一律用陶土和木材制成，只是形似。对于这样的陪葬品，盗墓贼也不会再动心思，所有人都省心了。后世子孙当以此为榜样。”
太宗时常思念长孙皇后。于是，太宗在后花园中搭建了一个观望台，时常向昭陵方向眺望。太宗曾让魏徵陪同自己登上观望台，让他向远处观望。魏徵向远处看了许久，然后对太宗说：“臣年老眼花，看不到。”太宗指着昭陵，让他看。魏徵说：“我以为陛下让臣登高台是为了眺望献陵。如果是让臣看昭陵，臣早就看到了。”太宗听闻此言后，悲伤地留下了眼泪。随后，太宗让人拆掉了这座观望台。