国民党政府不仅不愿意成立“联合政府”，反而发表声明，将国共谈判无成效的责任推到共产党身上。2月15日，周恩来代表中共中央就此发表声明，谴责国民党代表王世杰前一天所作关于国共谈判的声明是“不坦白和不公平的”，说明由于国民党当局在谈判中坚持要中共交出军队，坚持不取消一党专政，反对成立民主的“联合政府”，才使得国共谈判毫无结果。第二天，周恩来飞返延安。
谈判是周恩来担任长江局副书记、南方局书记时的主要任务之一。谈判耗费了他大量精力。1946年周恩来在接受《大公报》记者采访时说：“重庆是个谈判的城市”，“差不多十年了，我一直为团结商谈奔走渝延之间。谈判耗去了我现有生命的五分之一，我已经谈老了！”
（二）军事磨擦：周恩来求平息，蒋介石欲拖延
周恩来与国民党当局谈判的另一个重要主题是解决军事磨擦。
国民党五届五中全会成为其积极抗战与消极抗战、积极反共的分水岭。1938年国民党南岳会议后，蒋介石就在长沙召开军事会议，决定派50个师进入敌后。五中全会后，国民党又增派一些军队和游击武装到敌后。这些军队名为牵制日军，实际上是限制八路军、新四军的发展，在共产党领导的抗日根据地周围，不断制造磨擦事件，袭击八路军、新四军。1939年1月20日，周恩来在与蒋介石会面时，就要求蒋解决上年秋以来国民党在河北、山东、陕甘宁等地制造磨擦及反共捕人的事件。他致信蒋介石，要求国共双方共同派人视察各地，以了解和解决问题。鉴于“蒋介石将一切问题均扣在解决河北地区国民党军队和八路军的冲突上”，周恩来提请朱德、彭德怀、杨尚昆早提具体意见，以便交涉。国共两党就军事磨擦尽管进行了一些谈判，为实际解决冲突做了一些努力，但由于顽固派反共的既定方针，不仅河北的磨擦在扩大，而且扩展到了整个华北地区。国民党军队竟然强占了陕甘宁边区的镇原等县，制造大小冲突数十起。为此，5月底，周恩来面见蒋介石，指出：河北问题不能解决，陕甘宁、晋察冀边区四周又起磨擦，“此系与中央防制异党活动的训令有关，我们已让无可让，只能起而自卫”，要求蒋下令撤换河北省主席，维持晋察冀边区现状，国民党军队退出侵占的陕甘宁边区各县，停止挑衅活动。
6月7日，周恩来又向陈诚转交了中共中央提出的解决国共冲突的几点建议，主要内容是：（一）关于陕甘宁边区问题，依原有18县划界，地方行政归边区政府负责主持，以前陕甘两省政府委派的县长及保安队，应撤回；划黄河之清涧、绥德、米脂、吴堡、葭县及神木、府谷各一部分为八路军河防部队及八路军补给区，在划界区内，中央不得派兵驻扎。（二）关于河北问题，允许共产党员及八路军代表有参加河北各级政府之权利，改组河北省政府，国共两党派代表在河北组成共同委员会，承认八路军为河北作战主力，应负晋察冀边区作战之责。（三）关于八路军问题，应扩编为三军九师并增加军饷，并准予建立各直属兵种。三天后，蒋介石约周恩来谈话。他向周恩来表明了自己的意见：“（一）关于共党问题之症结，目前不在陕北几个县，而在共党应有根本的进一步之真诚，服从中央命令，执行国家法令，为全国革命之楷模，而不自居于整个国家体制之外，造成特殊关系，为一般封建者为借口；（二）余为全国革命领袖，以完全理智的及持平的态度处理国事，绝不偏听任何人或某一人之报告而所偏倚，余之权衡一切，完全以国家民族整个民族利益为前提，余为革命计，决不能有所迁就或姑息。”从蒋的话中可以明显看出，他关心的不是如何解决国共两党军队之间的磨擦问题，而是让中共“服从中央命令，执行国家法令”问题，在玩弄哄、压的权术。周恩来一听就知道蒋的葫芦里装的什么药。他对蒋介石说：委员长能以理智持平态度处理国事，在国共两军冲突上不偏不倚，自然最好。这也是中共所希望和一贯欢迎的。但是在双方冲突不断的情况下，不问原由，单方面要中共及其军队首先服从命令，这恐怕难解决好国共关系，缓和冲突，平息事态。他希望蒋介石能够以不偏不倚之态度，考虑中共提出的要求和解决问题的办法。
6月中旬，周恩来、叶剑英面见蒋介石，谈国民党河北民军总指挥张荫梧率部袭击冀东深县八路军后方机关，屠杀八路军指战员的问题。蒋介石重弹“服从中央命令，执行国家法令”的老调，坚持说：八路军不停止进攻就不能谈判具体问题。周恩来向蒋指出：并非八路军进攻，而是八路军被人所攻，八路军的行为是自卫行动。叶剑英还列举了国民党军队在陕甘宁边区四周不断挑起武装冲突、强占镇原、旬邑等县的事实，指出这些都是奉国民党政府军事委员会命令所为。在周、叶的严正要求和据理反驳下，蒋不得不答应由双方派员调查。
然而，蒋介石没有解决问题的诚意。继制造河北深县惨案后，国民党军队又制造了平江惨案，国民党第二十七集团军杨森部包围湖南平江嘉义新四军留守通讯处，杀害新四军上校参议涂正坤等10人。不仅如此，陈诚还主持制定了《共党问题处置办法》，在军事方面对八路军、新四军作了各种限制。主要内容有：
八路军、新四军必须服从中央之军令政令，旧八路军番号即令取消；
正规军只有驻地，不设防区，八路军、新四军不得要求划给防区：
游击部队可划给防区，但不得随意脱离防区，八路军、新四军派遣游击部队，事先须请示中央，否则以违抗军令处置；
八路军、新四军不准自由招募，不准就地筹粮或收缴民枪；
八路军、新四军开辟的根据地的政权建立，仍由国民党政府负责委派官员；
军事委员会派员在八路军、新四军之驻区监视；
共产党不得以军队或其他名义，随地在后方设立办事处，须经中央批准。
不难看出，国民党方面此时虽未下决心消灭中共，但已决心全力削弱中共，限制中共的发展。
7月2日，周恩来致电陈诚，对国民党军队不断挑起磨擦、制造平江惨案的行径表示抗议，揭露国民党军队残杀八路军、新四军指战员的罪行。他指出：“北事未平南变又起，推波助澜者大有人在。此种阴谋，弟敢断言决非止于反共，其目的必在造成国共裂痕，以便其破坏抗战，走入不得不对日妥协之途，其处心之深，用意之毒，显系破坏分子所为。”他要求陈诚转告蒋介石查明真相，严惩肇事者，保证不再发生类似事件。7月5日、20日，已回到延安的周恩来分别致电程潜、朱绍良，要求公开解决有关国共之间的冲突纠纷，约束所部“勿再故生是非”，“以利团结”。8月2日，周恩来再次致电陈诚，驳斥陈诚关于河北事件的诬蔑和不实之词，要求国民党方面派员会同中共前往进行调查。蒋介石尽管一再答应派员会同调查，却又以各种借口，一拖再拖，致使各地磨擦不断扩大，并制造了震惊中外的皖南事变。
皖南事变后，周恩来会同叶剑英、林彪等人就释放新四军被俘人员，恢复新四军番号，中共军队扩编为两个集团军，发饷、发弹等问题与国民党当局谈判，但都没有实质性的进展。
三、皖南事变前后：力阻反共高潮发生，政治上组织全面反击
皖南事变是维系抗日民族统一战线过程中出现的最严重的事件，将国共两党合作抗日的关系推向了破裂的边缘。周恩来在皖南事变爆发前，领导南方局全力阻止顽固派的反共阴谋；事变爆发后，认真执行中共中央政治上全面反击国民党顽固派的方针，多方出击，给蒋介石以沉重的打击。
（一）与国民党当局谈判，极力阻止反共阴谋的再次发生
抗战进入相持阶段后，日本政府对国民党政府的利诱，产生了明显的作用。1939年1月，国民党五届五中全会后，先是制造了一系列反共军事磨擦，挑起第一次反共高潮，后又企图将八路军、新四军赶到旧黄河以北，借日军之手消灭。为了阻止国民党正在酝酿的第二次反共高潮，1940年5月4日，毛泽东在给中共中央东南局的指示《放手发展抗日力量，抵抗反共顽固派进攻》中就提出：“在国民党反共顽固派坚决地执行其防共、限共、反共政策，并以此为投降日本的准备的时候，我们应强调斗争，不应强调统一，否则就会是绝大的错误”，“这种斗争，应从有理、有利、有节的原则出发”。按照这个指示精神，1940年6月，从苏联疗伤回国不久的周恩来，一到重庆，就开始与国民党政府举行正式谈判。
在与蒋介石的谈判中，周恩来严正指出：中共诚意拥护抗战并拥护蒋委员长，而国民党却在抗战中实行“反共”、“溶共”、“剿共”政策，这只能帮助敌伪。中共诚意希望合作到底，而有人却想分裂，准备投降。针对蒋介石“国共间一切问题都好解决，但军事上必须服从命令”的说法，周恩来指出，这要从两方面看，一方面是服从，另一方面不应拿命令来胁迫。事后，周恩来报告中共中央：蒋介石对国共破裂未下最后决心，但投降的危险日益增加。
接着，周恩来与国民政府军事委员会的正副参谋总长何应钦、白崇禧进行了多次会谈。主要谈了四个问题：一是中国共产党的合法地位问题，二是陕甘宁边区的承认问题。三是八路军、新四军的扩编问题，四是作战地区的划分问题。中心问题是划分作战区域问题。国民党当局要求八路军、新四军全部开到旧黄河北岸，企图假敌人之手消灭之。何应钦等人甚至说，“划界”是为了避免磨擦。对此，周恩来表示，原则上同意划界，但必须实现六个条件：（一）各党派在全国的合法权；（二）人民在全部敌占区的游击权；（三）八路军、新四军有正规的足够的战区（华北五省）；（四）八路军、新四军有足够的补给；（五）中共有冀、察两省的行政领导权和其他游击区的行政权；（六）八路军、新四军有发展的保证（扩充补给）。7月16日，国民党当局搞了一个“中央提示案”，要求取消陕甘宁边区，缩编八路军、新四军，并限制其防地，实际上拒绝了周恩来代表中共中央提出的六个条件。之后，周恩来代表中共中央又提出了多种方案，都被国民党当局拒绝。国共谈判陷入了僵局。随着国际局势的变化，蒋介石终于下定了发动皖南事变的决心。
回到重庆后的半年时间内（去掉中间回延安的近一个月时间，实际不到半年），周恩来与蒋介石本人进行了三次会晤，与何应钦、白崇禧等多次谈判，虽然没有从根本上阻止国民党反共高潮的发生，但对于此时举棋不定的蒋介石来说，谈判无疑延缓了其反共步伐的推进，为中国共产党的反击争取了时间。
（二）回复何白“皓电”，贡献甚巨。1940年9月27日，德、意、日三国在柏林签订协定，正式结成军事同盟，企图利用欧洲战场的有利时机，对美、英、法等国在太平洋上的殖民地发动军事进攻。军事同盟急于从中国战场脱身而出，为此他们对蒋介石开始了新一轮劝降活动。在这前后，英美为了自身的利益，需要中国拖住日本，也对蒋介石极力拉拢。英国政府于10月18日开放滇缅公路，美国国会同意向蒋介石提供一亿美元贷款。苏联也在拉拢蒋介石。两大集团都在争取蒋介石。德、意、日要求国民党政府放弃抗日。加入他们的阵营。英、美、苏则要求国民党加入他们的同盟。在这种形势下，蒋介石认为有利可图，可以为所欲为了。
10月19日，在蒋介石的授意下，何应钦、白崇禧以正副总参谋长名义，发表了致八路军正副总司令朱德、彭德怀和新四军军长叶挺的“皓电”，将国民党在7月间提出的“中央提示案”以最后通牒的形式抛出，限八路军、新四军在电到一个月内全部开到旧黄河以北。同时国民政府军委会军令部向国民政府第三战区司令长官顾祝同发布了围攻新四军的密令。
“皓电”的发表，拉开了第二次反共高潮的序幕。这次反共高潮是抗日战争期间国共两党关系史上最为严重的事件。由于国民党顽固派制造了震惊世界的皖南事变，两党关系几乎彻底破裂，全面内战一触即发。在这个形势最为错综复杂、其变化最为扑朔迷离的重大历史关头，周恩来积极参与了打退国民党顽固派挑起的第二次反共高潮的全过程，协助中共中央制定了粉碎顽固派反共阴谋的正确方针、政策和策略；在重庆，开展了大量的统战工作和外交活动，为揭露蒋介石集团的反共真相四处奔走，为捍卫新四军付出了巨大的心血。
“皓电”的发表，无论在延安、在重庆，还是在全国其他地方都引起了反响。如何处置“皓电”是中共中央必须考虑好的一个紧迫问题。周恩来为中共中央回复“皓电”，做出了突出的贡献。
第一，广泛与各方联络，多方收集反应，供中共中央参考。“皓电”发表后，周恩来为了分化顽固派，争取中间派，带领南方局的同志与国民党元老派冯玉祥、孙科、覃振等及中间党派人士章伯钧、沈钧儒、黄炎培、左舜生、邹韬奋、张申府等广泛接触，交换看法，征求他们的意见，并通过他们对国民党施加影响。在国民党元老派和中间党派人士中，虽然也有人主张中共对蒋介石采取强硬办法，如沈钧儒“主张发动反对内战，实行反攻的运动”，但总体上都希望中共“让一步，使分开蒋、何，分化何、白，孤立亲日派，以挽危局”。冯玉祥还特意托周恩来转告毛泽东、朱德，“无论如何不与蒋分裂，要软硬兼施，表面让步，实际自干”。甚至连反共老手白崇禧、张群也希望调解国共关系，希望中共能让步。周恩来还与苏联驻华大使潘友新商谈了时局。潘友新向周表示：仅据现有材料尚难判定蒋介石已与日本妥协，并说：“非新四军从江南撤退不能使蒋满意和停止‘剿共’战争”。
周恩来把这些反应及时地电告了中共中央，为回复“皓电”提供了有力的决策依据。