到1967年的3月间，毛泽东对刘少奇的态度有了新的变化。康生利用一份诬蔑刘少奇是“叛徒”的材料，给毛泽东写了报告，称他已掌握确凿材料，证明刘少奇在历史上有重大叛变嫌疑问题，建议中央对刘少奇进行专案审查。3月21日，毛泽东批准了康生的报告。中央常委决定审查刘少奇1925年、1927年、1929年、1936年的所谓“叛徒嫌疑”问题。6月3日，刘少奇、王光美专案组成立。中央决定审查刘少奇后，刘少奇问题的性质发生了变化，对刘少奇的批判斗争随之升级。
在3月召开的军以上干部会议和4月间召开的军委扩大会议上，陈伯达、康生等人讲话，从历史到现实的一系列重大问题上污蔑刘少奇、邓小平、彭真，颠倒是非地批判了刘少奇发展生产力的主张，并传达了毛泽东2月份与张、姚谈话中有关批判《论共产党员的修养》的意见。
刘少奇与外界的联系切断后，他的子女们从街上带回的传单小报和所见所闻就成了重要的信息来源。3月28日，子女们从街上带回了一些传单小报，其中一张小报说，刘少奇曾吹捧电影《清宫秘史》是“爱国主义”的，还说刘少奇自诩为“红色买办”。刘少奇敏锐地觉察到，这是一个不寻常的信号，立即回办公室给毛泽东写了一封信，申明从来没有说过这句话，愿意和揭发人对质。
4月1日戚本禹在《红旗》杂志第5期发表文章《爱国主义还是卖国主义？——评反动影片（清宫秘史）》一文，以批判刘少奇“吹捧”《清宫秘史》为题，肆意曲解历史，污蔑刘少奇从历史上就是钻进党内的反革命。文章用“党内最大的走资本主义道路的当权派”作为刘少奇的代名词，进行不指名的点名批判，给刘少奇扣了一堆罪名，向刘少奇提问八个“为什么”：为什么在抗战爆发前夕指使别人自首变节，发表“反共启事”？为什么在抗战胜利后，提出“和平民主新阶段”的投降主义路线？为什么在解放后极力反对社会主义改造，反对农业合作化，大砍合作社？为什么在三大改造后，积极主张阶级合作，取消阶级斗争？为什么在三年困难时期，鼓吹“三自一包”“三和一少”，攻击三面红旗？为什么在1962年还重新出版《论共产党员的修养》？为什么提出和推行形“左”实右的机会主义路线，破坏社教运动？为什么在“文革”中提出和推行资产阶级反动路线？这八条罪状完全是颠倒是非，歪曲历史，捕风捉影，无限上纲。但文章居然还据此作出结论，称：“答案只有一个：你根本不是什么‘老革命’！你是假革命、反革命，你就是睡在我们身边的赫鲁晓夫！”这篇文章是经毛泽东批准，在中央报刊上发表的“权威”文章。刘少奇看到戚本禹的这篇文章后，气愤至极，说：“这篇文章有许多假话，我什么时候说过那个电影是爱国主义的？什么时候说过当‘红色买办’？不符合事实，是栽赃！党内斗争从来没有过这么不严肃！”
此后，全国掀起了批判与打倒刘少奇的高潮。4月8日《人民日报》发表重要社论《高举无产阶级的革命的批判旗帜》，号召开展这场大批判。5月8日，《人民日报》《红旗》杂志发表文章《〈修养〉的要害是背叛无产阶级专政》。 5月 11日，中共中央发出通知，说明5月8日的文章是经政治局常委扩大会议通过，并经毛泽东亲自批准的重要文章，要求各单位认真学习讨论，“进一步深入地开展对党内最大的一小撮走资本主义道路当权派的大批判运动。”
当时在刘少奇身边工作的秘书、警卫、服务人员也成立了名称为“南海卫东革命造反队”的组织，为表示自己并非“保皇派”，在4月6日、12日对刘少奇采取了“革命行动”。4月6日晚，这些“造反派”冲进刘少奇的办公室，向刘少奇宣布了三条勒令：从今以后，必须自己做饭，自己打扫卫生、洗衣服，改变作息时间（刘少奇的工作习惯是夜里工作，上午睡觉）。他们还就戚文中的“八条罪状”逐一提出质问，要刘少奇回答并写出交代。刘少奇义正词严地回答说：“戚本禹这篇文章不符合实际，不符合事实，栽赃！我不反对革命，也不反对毛泽东思想，毛泽东思想是我第一个提出来的，我宣传毛泽东思想不比别人少。”刘少奇依据事实对戚文的“八大罪状”逐一据理驳斥并气愤地说，“宪法是我作的报告，我现在还是中华人民共和国主席，到法庭上审判我，要经过全国代表大会撤职。是谁免的我的国家主席？！”
4月7日，刘少奇交出一篇对戚文提出的“八大罪状”的答辩书。答辩分八个问题，针对“八大罪状”，说明了一部分事实真相。在回答为什么在“文化大革命”中提出和推行“资产阶级反动路线”的问题上，刘少奇说：“我现在也不清楚为什么？也没有看到一篇能够完全说清楚为什么犯错误路线的文章。在八届十一中全会上批判了我的错误之后，又有人犯同类性质的错误，可是，他们也不知为什么。”这是刘少奇用他当时所能运用的方式，表示他对“文化大革命”的反对意见。工作人员把原件上送，并抄了一份大字报在中南海内贴出。几小时后，这张答辩的大字报就被撕得粉碎。4月12日，中南海里的造反派再次批斗刘少奇。当刘少奇用事实答辩时，他们就用语录本敲打他的脸和嘴巴，叫嚷“不准放毒”。
4月10日，经中央批准，在清华大学举行30万人的批斗会，批斗王光美，彭真、薄一波、陆定一、蒋南翔等人陪斗。批斗会上，一伙人对王光美拳打脚踢，强迫她穿旗袍、戴用乒乓球串成的项链。王光美坚决抗议这种人格侮辱，进行了长时期的答辩，说明了一部分事实真相。
在大批判的狂澜中，北京建工学院“新八一战斗团”“勒令”刘少奇就“文化大革命”初期过问建工学院运动的事情交出检查。7月4日晚，中央办公厅主任汪东兴传达了中央的意见，要刘少奇向建工学院群众组织写一个检查。刘少奇此时已心力交瘁，难以执笔，只得由王光美代写。刘少奇审阅时，又加上一句“是毛主席党中央委托我主持中央日常工作的。”“检查”说明了刘少奇过问北京建工学院“文化大革命”的前后经过，以及“50多天里”“犯错误”的经过。较之1966年10月刘少奇在中央工作会议上的检查，这份检查更如实说明了一些事实情况。“检查”交上后，被极左思潮所支配的红卫兵们为之激怒，斥责为“反攻倒算，妄图翻案”，“向无产阶级革命派最疯狂的反扑”。从7月13日起，数百个单位的群众组织陆续赶到中南海的西门和北门，安营扎寨，组织“揪刘火线”，要把刘少奇揪出中南海。数十万之众的“揪刘”队伍，用上百个高音喇叭日夜对着中南海叫喊，并进行“揪刘绝食”，轮番批斗中央各部部长和省委书记们，还多次冲击中南海，要把刘少奇揪出来。
戚本禹煽动中南海机关的一些人，于7月14日强迫刘少奇出来看大字报，并进行围斗。7月17日晚，江青、康生、陈伯达、戚本禹等人在人民大会堂开会，擅自决定了对刘少奇、邓小平、陶铸夫妇进行批斗，同时抄家，批斗后对刘少奇、王光美分别“监护”。18日凌晨1点多钟，戚本禹召集中南海机关的造反派开会，决定批斗方式、规模、日期。18日晚，中南海“造反派”300多人把刘少奇、王光美分别揪到中南海内的两个食堂，批斗两个多小时。同时抄了刘少奇的家。批斗完后，刘少奇和他的家人被隔离起来。刘少奇押在前院，子女们在中院，王光美押在后院，分别看管，互不见面。
8月5日，“中央文革”在天安门广场组织百万人的“纪念《炮打司令部》发表一周年，批判刘、邓、陶大会”。同时，在中南海内组织批斗刘、邓、陶。批斗情况拍电影，向大会做实况广播。8月5日下午，中南海里的三四百人分三处在各家院内批斗了刘少奇、王光美，邓小平、卓琳，陶铸、曾志。刘少奇被拧着胳膊架进会场，又推又搡，强迫低头弯腰，并拧胳膊，扭手，揪头发。造反派还把一幅画着绞索、红卫兵笔尖的漫画强行套在刘少奇头上。经过两个多小时的批斗，69岁的刘少奇白发蓬乱，衣服湿透，腰腿受伤，疲惫不堪，行走困难。他被押回办公室后，按铃唤来机要秘书，拿出了一本《中华人民共和国宪法》，抗议说“我是中华人民共和国的主席，你们怎样对待我个人，这无关紧要，但我要捍卫国家主席的尊严。谁罢免了我国家主席的职务？要审判，也要通过人民代表大会。你们这样做，是在侮辱我们的国家。我个人也是一个公民，为什么不让我讲话？宪法保障每一个公民的人身权利不受侵犯，破坏宪法的人是要受到法律的严厉制裁的。”秘书连夜给中央写了汇报，但没得到任何回答。这是第六次批斗刘少奇、王光美，也是最厉害的一次。
9月13日，王光美正式被捕入狱。刘少奇的子女们也被赶出中南海。
在对刘少奇进行全民大批判的同时，对刘少奇专案的审查也在紧锣密鼓地进行。1967年3月，中央决定审查刘少奇后，王光美专案组的人数就增加了，由原来的4个人增加到40人左右。5月18日，专案组到中组部调走了刘少奇的全部档案材料。6月3日，刘少奇、王光美专案组成立。组长是周恩来，工作由谢富治、汪东兴主持，康生、陈伯达是顾问。江青在组内没有职务，但一切事情都得听命于她。1968年2月22日，谢富治在专案组的一份报告上批示：“大叛徒刘少奇一案，主要工作都是由江青同志亲自抓的。今后一切重要情况的报告和请示都要直接报告江青同志。”他还专门开会向专案人员交代：“要有组织观念，脑子里要有个江青同志，重大事要请示江青同志，有利于把案子搞好，有利于把叛徒抓完，有利于把文化大革命搞好。”
为了搞到刘少奇的罪证材料，专案组动用了大量的人力物力，在全国范围查找材料，查找所谓“知情人”，并且关押审讯知情人，软硬兼施，威逼利诱，不择手段地逼取口供。仅专案组直接关押的就有64人。
刘少奇冤案主要根据两个人的证明材料。一个是1927年与他有过工作关系，后来脱党的丁觉群。一个是与他一起在满洲奉天被拘留过的孟用潜。他俩都是在逼供下说了假话，但马上就翻供了。孟用潜先后写了20多份申诉翻供材料。但他们每翻供一次，专案组就是说他们不老实，就打他们的态度。专案组感兴趣的只是对制造冤案有用的伪证材料。1967年9月，丁觉群给专案组人员附信说明：“为了批倒批臭刘少奇，我这份材料是打破事实框框写的。”实际上，整个《审查报告》都是打破事实框框写的。
1968年2月，刘少奇专案的材料大体搞得差不多了，中办政治部要刘少奇就群众组织提出的问题写个材料。12日刘少奇写好交上。刘少奇在材料中申明没叛变过。16日江青看了这个材料后批：胡说！要专案组考虑。1968年9月，刘少奇专案的罗织诬陷最后完成，向中央报送了刘少奇的3本“罪证”材料。并以江青等4人的名义把材料上报毛泽东。毛泽东批示：“阅过了，没有按历史顺序排列。”
9月16日，江青在他们罗织编造的刘少奇“罪证”材料上批道：“我愤怒！我憎恨！一定要把无产阶级文化大革命进行到底！刘少奇是个大叛徒，大内奸，大工贼，大特务，大反革命，可说是五毒俱全的最阴险，最凶狠，最狡猾，最歹毒的阶级敌人。”
9月17日，康生给江青写信，称刘少奇是“大叛徒、大内奸、大特务、大工贼、大卖国贼、大汉奸”，并推断：“我觉得他这样早、这样久的作潜伏的内奸活动，似乎很早就受到帝国主义的特务训练的。”
9月29日，林彪看了江青的批语，批写“完全同意”，“向出色地指导专案工作并取得巨大成就的江青同志致敬！”
1968年10月13日至31日，中共八届十二中全会（扩大）在北京召开。会议是在极不正常的情况下召开的。195名中央委员和候补中央委员，71%被打成有各种问题的。97名中委除去世10名外，只有40人允许参加会议。因不足法定人数，开会时就有选择地从候补中委中递补了10人才过半数。江青、康生、谢富治等把“三本罪证材料”加以综合，写成《关于叛徒、内奸、工贼刘少奇的罪行的审查报告》（以下简称《审查报告》），由张春桥修改定稿后提交会议。全会在最后一天批准通过了这个《审查报告》，通过了“撤销刘少奇党内外一切职务，永远开除出党”的决议。
这次全会从组织上完成了打倒刘少奇的手续，并号召全党“深入开展革命大批判，肃清刘少奇反革命修正主义思想”。在表决时，中央委员陈少敏对《审查报告》拒绝表态，在全会通过时硬是没举手。
刘少奇被打倒后，遭到种种诬陷和身心迫害，精神上受到很大刺激，生活上也得不到应有的照料，健康状况急剧恶化。1968年7月9日，他支气管炎转化为肺炎，生命垂危，经抢救得以脱险。此后身体完全垮了，从1968年10月起就不能进食，靠鼻饲维持生命。他对于对他的立案审查和八届十二中全会的情况都一无所知。1969年9月中央对他组织了一次会诊，医生估计可能过不去冬天。1969年10月，中央估计苏联可能会对我国发动突然袭击，决定把重要审查对象紧急疏散到各地。10月17日，刘少奇被转移到河南开封。经这一折腾，到11月12日晨，刘少奇就含冤逝世了。
刘少奇的被打倒，不是他个人的问题，而是作为一条反对社会主义的资本主义路线、一个与毛泽东无产阶级司令部分庭抗礼的资产阶级司令部提出来的。刘少奇是“党内反革命修正主义集团的总头目”，“资本主义复辟势力的总代表”，“党内头号走资本主义道路的当权派”，因此株连了从中央到地方的为数众多的各级干部，殃及成千上万的无辜民众。一大批党、政、军领导干部被诬为“刘少奇的代理人”，各个行业的工作方针被诬为“刘少奇修正主义路线”，普通党员和基层干部被诬为“刘修党员”“黑爪牙”。因刘少奇问题而受到株连、批判、打击、判刑的人难以数计。仅被错判的刑事案件就达22053件，不少人被迫害致残致死。
“文化大革命”结束，中共十一届三中全会后的1979年2月，中共中央责成中央纪律检查委员会和中央组织部对刘少奇一案进行复查。复查组经过周密地核查，证明《审查报告》强加给刘少奇的种种罪名没有一项可以成立，都是伪证。1979年11月，“刘少奇案件复查组”向中央正式提出了《关于刘少奇案件的复查情况报告》。12月，邓小平、陈云、邓颖超、胡耀邦等审阅复查报告后表示同意。邓小平并提议，可考虑将这一报告作为中央对刘少奇案件的平反决定。
1980年2月初，中共中央政治局讨论并同意《关于为刘少奇同志平反的决议(草案)》，决定提交即将召开的中共十一届五中全会审议。1980年2月，中共十一届五中全会讨论通过了《关于为刘少奇同志平反的决议》，决定撤销中共八届十二中全会的决议，否定强加在刘少奇身上的诸多罪名和各种不实之词，恢复他的政治名誉，彻底为其平反昭雪，并对因刘少奇问题受株连的冤假错案进行平反。5月17日，中共中央在北京为刘少奇隆重举行追悼大会。刘少奇的骨灰按照他生前的遗愿撒向了浩瀚的海洋。
历史终于证实了刘少奇在最艰难时说的一句话——“好在历史是人民写的”！