在“文化大革命”中，周恩来原来甚为健康的身体，由于长期过度紧张、繁忙而急剧衰弱，除得了心脏病而且屡次发作外，1972年5月，医护人员发现周恩来小便中红血球增加，并有细胞变异现象。经专家会诊，确诊为膀胱癌。11月，医生向叶剑英、李先念等报告，认为周恩来要特别注意休息。这个报告送给了毛泽东，毛泽东阅后批道：应当休息、节劳，不可大意。但周恩来万机待理，不可能真正地得到休息。因治疗一再延宕，到1973年1月5日，大量便血。3月9日，周恩来主持中央政治局会议，根据毛泽东的意见，说明了便血的情况，向政治局请假两星期，并提议在自己去玉泉山检查身体期间，政治局会议和报告由叶剑英主持和签署，还建议抓紧解放干部的工作。10日，他致信毛泽东报告会议情况，毛泽东批：同意。3月10日到24日，周恩来到玉泉山进行检查治疗。10日晚，做了一次手术。4月9日，周恩来专门约邓小平、卓琳谈话。5月20日，他主持中央工作会议全体会议，在讲话中特别表示欢迎邓小平出席这次会议，说对于中央恢复邓小平职务，“绝大多数同志都是满意的”。12月12日，周恩来到毛泽东处参加中央政治局会议，毛泽东在谈话中提出八大军区司令员对调和邓小平参加军委任总参谋长的建议。接着，周恩来忙于八大军区司令员对调的部署，主持中央政治局会议和陪同毛泽东接见参加中央军委会议的人员。22日，他起草了中共中央关于决定邓小平为中央政治局委员、中央军委委员并参加中央和军委领导工作的通知，并于当日主持中央政治局会议通过。1974年1月18日，周恩来主持中央政治局会议。会议提议军委成立由叶剑英牵头，有王洪文、张春桥、邓小平、陈锡联参加的五人小组，讨论处理军委的大事和紧急作战事项。20日，中央政治局会议正式向毛泽东提出这一建议，毛泽东表示同意。至此，邓小平接替周恩来的格局已经有了初步的安排。
1974年年初，周恩来病情加重。1月20日后，连续作治疗。24日，江青一伙背着毛泽东召开在京军队单位批林批孔动员大会，25日，又召开中央直属机关和国家机关批林批孔大会。这两次大会，经过江青一伙策划，迟群、谢静宜等作了煽动性讲话，把矛头直指周恩来和中央其他领导同志。他们以批“周公”、批“宰相”来影射攻击周恩来。4月底以后，周恩来病情日益加重。6月1日，他又做了一次大手术，此后就住在305医院里了。6月14日，江青召集会议，授意她的写作班子“要批现代的儒”，说“写老的儒有问题，不然只是刘、林”，对“现在的儒应写文章”。10月17日，江青等在中共中央政治局会议上又利用“风庆轮”事件围攻邓小平，矛头指向周恩来。11月上旬，周恩来在医院里分三批约中央政治局成员开会，解决了“风庆轮”事件问题。
1974年年底，周恩来不顾病情的发展，为了主持开好中共十届二中全会和第四届人民代表大会第一次会议，仍然紧张地工作着。由于得到毛泽东的支持，他挫败了江青反革命集团篡党夺权的阴谋。在四届人大的人事安排上，江青、张春桥等人竭力争取要把他们的亲信安排在文化、教育、体委三个部委的领导岗位。周恩来约李先念等交换意见，感到教育部关系重大，确定以周荣鑫掌管为宜。12月23日，周恩来以重病之身，还远行千里，飞赴长沙，向毛泽东汇报四届人大的筹备情况。这一次，还同毛泽东单独谈了话，提到怀疑江青、张春桥历史上有严重政治问题的事情，毛泽东表示已经知道了。在谈话中，毛泽东称赞邓小平“人才难得，政治思想强”，提议中共十届二中全会增补他为中央副主席，还对周恩来说，不要老闷在医院里，可以出来走走，告诉邓小平在京主持工作。这次，周恩来回到北京下飞机前，坚持叫秘书搀着到驾驶舱看望机组人员，同他们一一握手告别。这是他最后一次乘坐飞机。这时，他的癌细胞已经转移到肠部。
1975年1月8日到10日，周恩来亲自主持中共十届二中全会，通过了四届人大的人事安排，并选举邓小平为中共中央副主席、中央政治局常委。“四人帮”组阁夺权的阴谋受到沉重打击。13日至17日，第四届全国人民代表大会第一次会议在北京召开。周恩来在会上作《政府工作报告》，重申了要实现农业、工业、国防和科学技术现代化的目标。会议选出了以朱德为委员长的人大常委会组成人员，任命周恩来为总理，邓小平等为副总理。1月下旬，周恩来连日在医院里主持中央政治局会议，讨论国务院副总理的分工问题。他嘱咐国务院核心小组副组长吴庆彤转告邓小平，请邓小平把分工列出，“他不好讲，由我讲”。2月1日，他主持了由总理、副总理13人出席和中央军委副主席叶剑英、科学院院长郭沫若列席的国务院常务会议，审定了国务院副总理的分工。同日，召开国务院各部、委负责人会议，传达了毛泽东对邓小平“人才难得，政治思想强”的评语，说：“将来这样的会，请小平同志主持。”第二天，他写信给毛泽东，谈了副总理的分工情况，说：“邓小平主管外事，在我治病疗养期间，代总理主持会议和呈批主要文件。”毛泽东圈阅了这封信。
1975年4月底，毛泽东从湖南回到北京。周恩来与毛泽东商定，由邓小平主持中央日常工作。邓小平主持工作后，召开了军委扩大会议和解决工业、农业、交通、科技等方面问题的一系列重要会议，着手对许多方面的工作进行整顿，形势有了明显的好转。
1975年9月7日，周恩来不顾病情严重恶化和医护人员的劝阻，会见了罗马尼亚党政代表团。这是他最后一次会见外宾。会谈中，他坦然地说：“马克思的请帖，我已经收到了。”他说：“现在，副总理已经全面负起责任来了。”向国外朋友介绍了邓小平。10月以后，周恩来病情继续恶化，卧床不起。24日，再次进行手术。在进入手术室前，周恩来躺在手推车上，向围绕在周围的政治局委员们询问小平同志来了没有，并握住走上前来的邓小平的手说：“你这一年来的工作，证明比我强得多。”表示了对邓小平的支持。
周恩来从1972年得了癌症后，作为病人，他应该休息治疗；作为一个对党和人民建立了丰功伟绩的七旬老人，更应该得到休息和疗养。一向工作起来不知疲倦的周恩来，这时候也向他身边的同志吐露，说自己感到疲乏。他何尝不想休息？但是，当时党和国家的现实，“四人帮”篡党夺权的图谋，他的举足轻重的重要性，使他不能够也不考虑休息疗养。他在医院的病床上，担心的是党和国家的前途和命运。正是为此，他患了重症却更加不分昼夜地工作，把生命倾注在保护党和人民的事业上，不顾病情的恶化，不顾“四人帮”的攻击叫嚣，全部心力完全彻底地贡献给了党、国家和人民。
周恩来晚年，胸前始终挂着一枚“为人民服务”的徽章。这是用意深刻的表明心境的证章。他公而无私，全心全意，决心把有限的生命完完全全地贡献给“为人民服务”的事业。邓颖超说过：“恩来对于自己个人离开人世没有丝毫挂虑，对祖国的科学发展和未来却充满了热情和期望。”这是十分真实的写照。
周恩来始终坚持着共产主义信念和革命乐观主义精神。在病中，他对关心他的亲属讲：“这有什么着急的？共产党员要唯物主义嘛！人生的规律都有这么一天，应该相信规律。”他确实对自己个人离开人世没有丝毫挂虑。在病痛的折磨之中，他同邓颖超一起吟唱《国际歌》。
1976年1月7日晚，周恩来微睁双眼，对病床前的医生吴阶平说：“我这里没有什么事了，你们还是去照顾别的生病的同志，那里需要你们。”
这是周恩来所说的最后一句话，他心里想的仍然是别人。
1976年1月8日9时57分，一代伟人周恩来溘然长逝，终年78岁。“巨星陨落，人们相告不成声，欲言泪复垂。”亿万人民和国际友人沉痛悼念周恩来。他一生的追求，一生的奋斗，都是为了人民的利益，为了祖国的富强，为了最终实现共产主义这一崇高的目标。