在变酸的样品中，看到的却是小得多的长圆条形的小生物。它们呈单独或不规则排列的群体。巴斯德把这种拉长了的球状物叫做乳酸酵母，也叫做酵素。
现在我们知道这种拉长了的球状物叫做乳酸链球菌。
巴斯德告诉比尔，正常的酒精中只有小圆球形的小生物；而在变酸的酒精中，却有比小圆球小得多的长条形的小生物。他要比尔在甜菜中加那种大一些的、圆形的发酵小生物。要是在甜菜汁中发现了那种小一些的长条形的小生物，就不要了，趁早倒掉。不要再花气力去干那些没有收获的事。巴斯德以这种简单的观察法来判断发酵进行的好或不好，使酒精酿造失败的次数大为减少。
巴斯德的发现，促进了法国发酵工业的发展。
巴斯德把酵母菌接种到含有酵母浸出物和糖液的试管里，培养后产生典型的酒精发酵。把变酸样品的沉淀物接种到含有酵母浸出物、糖液和碳酸钙的试管里，培养后产生的产品不是酒精，而是乳酸。
巴斯德把两种发酵与两种形态上不同的生物联系了起来，提出了全新的发酵理论，认为发酵的真正原因是微生物。这一观点他是在1857 年的《关于乳酸的记录》一文中提出的。在这篇论文里。他用改变添加到培养基中碳酸钙量的方法，第一次证明了pH 对微生物代谢的影响。这篇论文被公认为是经典著作，它不仅使人们知道了发酵的本质，还建立了导致传染病里由特定病因引起的概念。同时巴斯德在论文中提出了配制培养基的基本原理，即碳源、氮源、盐类、维生素和pH 等。这篇论文为现代微生物学和微生物化学奠定了基础，使微生物学由推测、观察时期，发展到培养时期。
1857 年，巴斯德调往巴黎的母校——高等师范学校，担任行政副校长兼理科主任，继续从事酒精发酵的研究。找不到适合做研究室的房子，他就把一间学校弃置的阁楼改造成研究室。巴斯德在洞穴般的研究室里进行研究工作。
在培养酵母的实验中，有一次，巴斯德在培养基中偶然没有加入酵母浸出物，却加了酒石酸铵。接种酵母菌后，酵母菌生长繁殖了。
巴斯德对发酵液中的酒石酸铵进行测定，发现铵盐减少了，也就是被酵母菌利用了。
经过进一步的试验证明，酵母菌在没有糖和氮源的条件下能生长；在只有糖的培养基中，酵母可以发酵，但不能繁殖；在加有糖和氮源（酵母浸出物或铵盐）的培养基中，酵母菌可以发酵，也能够进行繁殖。
巴斯德在这年12 月向法国科学院提出了论述酒精发酵的论文。巴斯德的结论是：没有活的酵母菌参与，糖绝不会进行酒精发酵。这说明了有生命的酵母菌和糖发酵的酒精之间的因果关系。
在这以后，巴斯德研究了氧气对酵母菌生长和酒精发酵的影响。在有氧时，酵母菌生长旺盛，产生1 份酵母菌体要消耗8—10 份的糖。在无氧时，酵母繁殖菌体的量变少，产生1 份酵母菌体要消耗60—80 份的糖，同时产生大量的酒精。这一工作开创了用定量方法研究微生物代谢的先例。酵母菌发酵糖除产生酒精和二氧化碳外，巴斯德还测出产有甘油、琥珀酸及测定不出来的其他产物。
由于巴斯德研究酒精发酵和乳酸发酵作出了杰出的贡献，法国科学院于1860 年1 月30 日授予他实验生理学奖。
从1861 年起巴斯德开始研究醋酸发酵和制酸了。他发表了许多将理论和工业生产相联系的论文。当时人们对醋酸发酵已有了深入研究，了解了酒精经氧化生成醋酸的化学过程。这一概念与德国制醋的方法相同。巴斯德研究醋酸发酵后发现，微生物对发酵是重要的，酒转变为醋是由醋酸醭酵母（醋酸菌）完成的。醋酸菌在发酵液表面形成菌膜，有时是平滑的，有时是有皱纹的，摸上去有油腻的感觉。醋酸菌的生长需要空气，不然就会死去，它从空气中吸取氧，把酒精氧化为醋酸。在发酵过程中，醋酸菌占优势，醋化便可成功。如果染有杂菌，醋化就会失败，在醋化完成之后，如果醋酸菌继续进行氧化，醋酸便进一步氧化为二氧化碳和水。这就给制醋业带来危害。
为了防止杂菌污染和醋酸菌的进一步氧化，巴斯德提出接种醋酸菌，发酵完成之后，用55℃加热的方法抑制醋酸菌和杂菌的活动和生长。用这种方法制醋，可提高产量3—5 倍，并大大减少了醋酸的挥发。
生物是自然发生的吗
巴斯德的研究证明，甜菜汁变成酒精是酵母菌活动的结果，它变成酸是乳酸链球菌活动引起的。可是，酵母菌和乳酸链球菌是怎样来的呢？巴斯德久久地思索着。为了继续探讨这一问题，他又着手进行生物自然发生说的研究。
生物自然发生说早在希腊时代就有了。这种理论认为生物只能通过自然发生才能产生，时时处处都在进行。16 世纪开始有人认为生物只能由生物而来，这种观点一度居于优势。17 世纪末发明了显微镜并发现了微生物，信仰自然发生说的人们把这一问题重新提了出来。在雨水中和暴露于空气中有机物的浸出液里，都能观察到极小的生物。对这一观象，部分科学家认为只能用自然发生说来解释。著名医生艾尔蒙甚至说：“把一些破烂的碎布和一块干牛奶酪放在一起，不消多久，就能变成一只小老鼠。” 巴斯德反对自然发生的说法。他认为，微生物也有它们自己的父母，不可能无中生有，自己长出来。要反驳艾尔蒙说的变小老鼠的戏法，还是比较容易的，你只要眼睁睁地守着那破布和牛奶酪，它就怎么也变不出小老鼠来。
可是，要反驳那种认为甜菜汁中的酵母菌是自己长出来的，却并不那么容易。
因为酵母菌这种小东西，用眼睛根本看不见。要反驳“自然发生说”的确得动一番脑筋。
围绕自然发生说，意大利牧师斯巴兰扎尼和英国的尼达姆之间发生了论战。尼达姆认为，经过煮沸然后密封在煮沸容器里的肉汤，可以自然地产生微生物。而斯巴兰扎尼反对这一观点。他把肉汤在预先密封的容器煮沸时，并延长了加热时间。实验证明只要加热的温度在水的沸点以上，防止加热后外界空气的进入，肉汤就能长久地保存，而不产生微生物。
1858 年12 月，法国科学院院士、里昂博物馆馆长普歇正式向法国科学院提出一篇《人造空气和空气中自然发生的植物和动物原生体小论》的论文，断言“生物自然发生是可能的”。他认为放在空气中的动物和植物，自己能长出微生物。
巴斯德不同意普歇的观点，认为这些微生物不是自己长出来的，而是从空气中进去后，在那里繁殖起来的。巴斯德没有公开反驳普歇，因为那时他手里的证据不足，他要用实验来证实自己的见解。
恩师毕奥知道了巴斯德的想法，就想劝阻他。毕奥说：“巴斯德先生，生物是否自然地发生，是个不可能解决的问题，你为什么想要研究这样的问题呢？”巴斯德回答道：“因为这个问题和我至今仍在研究的发酵问题有密切的关系。引起发酵的是叫酵母菌的微生物，我很想知道它是从那里来的。
如能彻底解决自然发生说这一问题，那么，我的发酵方面的研究就可以顺利进行，所以，这个研究对我是绝对必要的。”恩师担心巴斯德一旦研究下去就脱不得身，而且说不定不会有什么确实的证据，还会影响他的其他研究工作，但固执的巴斯德还是执意回答：“总得试一试看。” 巴斯德的另一位恩师塞纳蒙听说了这件事，他深信巴斯德的才能，说道：
“巴斯德向来都耐心研究一些看来没法解决的问题，结果都解决了。说不定这一问题也能被他解决，何不让他去试一试呢？” 巴斯德又开始了新的研究。这时他的研究室从小阁楼转移到校门口守卫室旁边的小建筑物里面，虽然仍很简陋，但比小阁楼宽大了。巴斯德有了一名年轻的助手名叫裘尔·罗兰。他是高等师范的毕业生，是第一个进入巴斯德研究室当助手的人。
开始研究的时候，巴斯德使吸入到容器里的空气先经过塞有棉花的管子，空气中的固体微粒便被棉花吸附，棉花变为黑色。结果，溶液腐败了，长出了微生物。巴斯德将带有固体微粒的黑色棉花浸泡在易腐溶液——肉汤中，观察其是否有微生物生长。巴斯德在另一个瓶子里也装入肉汤，他把肉汤煮沸，然后把瓶口的玻璃烧红后，把瓶口封死。这种肉汤不论放置多久，总也不会腐败，长不出微生物来。
经过一年的研究，巴斯德终于得出如下的结论：空气中飘浮的东西，除了微生物的孢子，都不具有形成生命的条件。
普歇反对巴斯德的这一结论，他认为，微生物是肉汤自己长出来的；生物的生长需要自然的空气，至于煮沸肉瓶中的空气是经过加热的，而微生物的生长需要自然的空气。
巴斯德为了证明生物是不能自然发生的，接受了化学家兼药剂师巴拉的建议，改进了试验的方法。巴斯德特地设计了一种玻璃烧瓶，即“天鹅颈瓶”。
巴斯德将肉汤倒入球形瓶中，将球形瓶置于高热火焰中加热煮沸。瓶颈用火焰加热后，拉成天鹅吃食样的小管，管口向下开着，不封死，瓶内的肉汤放很长的时间也不会长微生物。原来肉汤在煮沸时，空气膨胀，把瓶颈中的空气排出去了，等冷却后，空气虽然又会回到瓶中去，可是因为空气中的微生物是有重量的，（因为它们依附于尘埃之上）它就落在曲颈上，微生物没有腿，所以跑不到瓶里去，瓶中的肉汤便没有微生物生长。但若将同样处理的烧瓶摇动，使肉汤溅到弯曲细长的管壁，再流回烧瓶，培养后的肉汤就变得浑浊，证明了有微生物生长，它们是由于尘埃带入的。
普歇仍然不服，他认为巴斯德说的空气中附着于尘埃之上的微生物根本不存在。巴斯德认为普歇的反驳是有道理的，怎样证明反流入瓶中的空气中一定有微生物呢？巴斯德决定继续实验。
1860 年9 月10 日，巴斯德做了几百个圆肚烧瓶，瓶中不用烧沸的肉汤，只用消过毒的肉汤。巴斯德将烧瓶放在水中煮沸几分钟，把瓶中的空气赶出去。同时用火焰烧熔瓶颈，拉成细长的小管并封住管口。如果折断小管，外界的空气就会带着尘埃进入瓶内，再把管口封住，放在温箱中培养。
巴斯德想，如果真是空气中会自然发生微生物的话，那么，不论什么地方的空气都应该是一样的。巴斯德把许多瓶肉汤分别放在空气很少流动的巴黎天文台地下室和空气流动的院子里，小心地把瓶子的颈口夹破，让空气进入瓶内，然后再用火封死。培养的结果表明：在地下室收集的10 瓶，除一瓶稍有浑浊外，全都透亮澄清，没有微生物生长；在院子里收集的11 瓶，都变得浑浊，都有微生物生长。
巴斯德还趁休假的机会，用同样的方法，在不同地区和在不同的海拔高度的地方收集空气。在汝拉高原之麓，10 个瓶中有8 个瓶子长了微生物。在海拔850 米的汝拉山上，10 个瓶中只有一个瓶子长了微生物。在海拔2000米的蒙唐威特山上，20 个瓶子中仅有一个瓶子的肉汤变浑浊。
根据试验的结果，巴斯德得出结论：随着海拔的升高，尘埃数量就越少，空气的流动也平稳，粘附在尘埃上的微生物也越少。因为漂浮于空气中的尘埃是侵入肉汤中生物的惟一来源，是肉汤变浑浊必不可少的条件。
1860 年11 月，巴斯德将他的试验结论正式向科学院提出报告，他写道：
“如果把总的结果互相比较，那么它们就证实：空气中包含的尘土是浸剂中生命形成的惟一基础、首要的和必要的条件。”巴斯德终于击败生物自然发生说，揭晓了“生物来自亲代的生物”的现象。
1862 年12 月，巴斯德当选为法国科学院院士。
1863 年，他的《空气中出现的最小生物》的论文获奖。
葡萄酒的疾病
巴斯德现今已是一个知名的微生物学家了。人们认为他是万能的神奇人物，碰到问题，就向他请教。
这时候，法国工业遇到一个大难题，这就是葡萄酒和啤酒变酸。
巴斯德的故乡阿尔布瓦是法国著名的葡萄酒产地，因为在酿造中的葡萄酒在桶内酸败的事情经常出现，而大受困扰。家乡的酒商们联名请求巴斯德来调查病因，他们愿为他提供研究所需要的费用。
接到家乡父老乡亲的请求，巴斯德立刻允诺，接受了这项工作，至于研究费用，他则拒绝了。
1864 年暑假，巴斯德来到他的家乡，调查葡萄酒腐败的原因。
巴斯德做研究用的实验室，就是家乡小镇入口处的一家老咖啡店。巴斯德和助手们把必要的设备安排在那里。这些设备都是委托家乡的木匠、板金工匠、铁匠等制造的，既粗糙又难看。因此，村民们对巴斯德他们显出失望的神情。一位助手对巴斯德说：“老师，当我们走过去的时候，镇里人们常以瞧不起人的眼光看着我们。” 巴斯德说：“不要放在心里，巴拉尔老师常常开玩笑说‘科学家的精神是物质困难越大越发奋’。以简陋的实验设备达成完美的研究才是我们的任务。”
当时，酿造中的葡萄酒变得酸酸、粘粘或苦苦的，以致失败的事情经常发生。这种葡萄酒的病被称为异常发酵。巴斯德对异常发酵极为感兴趣。早在1863 年他就开始研究了。巴斯德已经在研究甜菜汁的发酵中，知道酒精变酸是微生物捣的鬼。他想：“葡萄酒的异常发酵，很可能是由于某种微生物落入葡萄酒中，生长繁殖引起的。” 巴斯德再次用显微镜发现酒中确实有些微生物，有的是圆形，有的是长棍形。圆形的微生物是酵母菌，长棍形的微生物是乳酸酵母。巴斯德发现凡是变酸的酒差不多都有乳酸酵母，它们繁殖越多，活动得越厉害，酒就越酸；而在好酒中，就见不到乳酸酵母。根据研究巴斯德肯定地对酒商们说，酒里面的那些小小的微生物，有的能使酒变香，有的能使酒变酸。
酒商们都不敢相信，他们认为巴斯德是在说大话。于是，他们搬来一箱子酒，让他鉴别一下哪些是好酒，哪些是酸酒。巴斯德笑了，他对酒商们说：
“这很简单，每一瓶酒我只要一滴酒，不用闻，也不用尝，只用显微镜一看，就能鉴别。” 对巴斯德的话，酒商们半信半疑。巴斯德把每一滴酒放在显微镜下观察，凡是只有圆球形微生物的酒，也就是只有酵母菌的酒，巴斯德就判定为好酒，凡是有长棍形微生物——乳酸酵母的酒，巴斯德就判定为是酸酒；乳酸酵母越多，他就判定酒越酸。
巴斯德的实验结果与实际情况符合，酒商们都点头称赞巴斯德高明。家乡的人对他们师徒不再持怀疑的态度了。他们请求巴斯德帮助他们解决怎么使酒不变酸。