（2）取2滴每个稀释度，加1滴5%试验所需的红细胞，混匀。
（3）室温孵育15min，离心，肉眼观察凝集。
（4）结果判断。根据与实验细胞反应的格局综合分析，确定冷反应抗体的特异性。
6．注意事项：根据病人血型选择相应的实验红细胞，以排除同种抗原抗体反应的干扰。
温自身抗体的吸收1．原理。有温自身抗体的患者血循环中的红细胞包被了自身抗体，血清中还可能还有这种游离抗体，有的甚至很多。这种患者的红细胞可能在试剂血清（如抗A，抗B）中发生凝集，甚至在盐水介质中自凝，干扰了血型鉴定、抗体检出和配血试验。用自身红细胞吸收去除这类温自身抗体，可使血清中同种异体抗体被检测出来。用自身红细胞吸收血清中的温自身抗体，同样先要去除红细胞上的自身抗体，再用这种细胞去吸收。
免疫球蛋白分子经巯基试剂处理后增加对蛋白酶的敏感性。当被免疫球蛋白致敏的红细胞用ZZAP试剂处理后，免疫球蛋白分子失去其完整性，并从红细胞膜上解离下来，蛋白酶的作用可增加处理后红细胞的吸收能力。近期输过血的人红细胞不应用于自身吸收，因为血液循环中被输入的红细胞可能吸收要被查找的同种异体抗体。
2．标本：待吸收的血清或血浆2ml、自身压积红细胞2ml。
3．试剂：ZZAP溶液（0.5ml的1%半胱氨酸活化的木瓜酶，加上2.5ml、0.2mol/LDTT和2mlpH值7.3的PBS，调整pH值为6.0～6.5）、生理盐水、6%牛白蛋白盐水溶液；4．器材：试管、试管架、移液器、台式离心机、恒温水浴箱。
5．操作步骤。
（1）热-酶处理细胞法。
①将2ml患者红细胞用生理盐水洗涤4次，每次尽可能吸净上层盐水；加入与压积红细胞等体积的6%牛白蛋白盐水溶液，混匀，置56℃水浴轻轻摇动5min。
②在56℃预温的离心管中，以3000r/min离心2min。收集压积红细胞备用；向压积红细胞中加入1%木瓜酶溶液1ml，混匀，37℃孵育15min，洗涤红细胞3次，末次3000r/min离心至少5min，并尽可能吸净上层盐水，将红细胞分为两份。
③在一份红细胞中加入患者血清2ml，混匀，37℃孵育30min，3000r/min离心2min，上层血清转入另一份红细胞中，重复一次。
（2）二流苏糖醇-木瓜酶处理法。
①在两支各有1ml压积的患者红细胞的试管中，分别加入2mlZZAP试剂，混匀，37℃孵育30min，用生理盐水洗涤3次，末次3000r/min离心至少5min，并尽可能吸净上清液。
②取2ml待检血清加入其中一支处理过的红细胞试管中，37℃孵育30min，3000r/min离心2min，将血清转入另一支试管中，重复一次。
③第二次吸收后，用该血清与O型试剂红细胞反应。如果仍有反应，再次重复。
（3）结果判断。
①如果血清中存在同种异体抗体，两次吸收后，一般可以去除自身抗体，使同种异体抗体能被检测出来。
②用抗体鉴定谱红细胞试剂，对经过两次吸收过的血清检测，若该血清表现出抗体特异性，则表示存在同种异体抗体。
③如果血清与所有谱红细胞都反应，就有必要继续吸收自身抗体。另外若是血清中含有的抗体（如抗Ge）不与ZZAP处理的红细胞反应，也不能应用本实验程序进行吸收。为证实这种可能，用以经过自身吸收过的血清与经ZZAP处理过的试剂红细胞反应。
6．注意事项。
（1）上述两种方法两次吸收后的血清，通常都能除净自身抗体，可用自身红细胞做间接抗球蛋白试验来检查自身细胞吸收的效果，但自身细胞本身要求直接抗球蛋白试验阴性。吸收以后的血清用来检测同种抗体的活性，选择没有与该抗体相应抗原的红细胞进行交叉配血。
（2）ZZAP处理破坏所有Kell系统抗原和能被蛋白酶破坏的血型抗原，包括M、N、Fya、Fyb和S。ZZAP试剂也破坏s抗原，以及LW、Gerbich、Cartwright、Domgbrock和Knops系统抗原。如果怀疑自身抗原的特异性属于这些血型系统中的任何一种，就必须换用其他自身吸收程序，如只用1%半胱氨酸激活木瓜酶或1%无花果酶处理的自身红细胞。
（3）在用ZZAP处理红细胞前，不必洗涤红细胞。
放散试验1．原理：红细胞上的抗原与血清中的抗体在适合条件下发生凝集或致敏。这种结合是可逆的，如果改变某些物理条件，抗体又可从结合的细胞上放散出，再以相应红细胞鉴定放散液内抗体的种类，并测定其强度，用以判定原来红细胞上抗原的类别。这种方法常用于ABO亚型的鉴定、全凝集或多凝集红细胞的定型、类B的鉴定以及新生儿溶血病的诊断等。
放散试验的方法很多，ABO血型IgM抗体以热放散法为常用。Rh血型IgG抗体以乙醚放散法为常用。
2．热放散法。
（1）标本：待检者红细胞。
（2）试剂：抗A及抗B分型血清、2%A型及B型试剂红细胞。
（3）器材：试管、试管架、台式离心机、56℃恒温水浴箱。
（4）操作步骤。
①将待检者红细胞以大量生理盐水洗涤3次，倾去洗涤液制备压积红细胞。加1/2容积的生理盐水（如放散液不立即进行检查，应以AB型血清代替生理盐水）。置56℃水浴中10min，每隔15s振摇1次，使吸附在红细胞上的抗体充分放散出。
②立即以3400r/min离心2min，离心管内放入温水，使温度尽量保持在56℃，分离得到的上清液即为放散液。
③将放散液用5%A型及B型试剂红细胞鉴定抗体或相应待检红细胞血型。
④结果判断。a.放散液和A型红细胞凝集而与B型红细胞不凝集者为A型，反之为B型；b.放散液和A型与B型红细胞均凝集者为AB型，如均不凝集则为O型。
（5）注意事项。
①为了使放散液内有更多的抗体，压积红细胞量应加大。
②放散时应严格注意温度和时间，温度过高，红细胞容易裂解；温度过低，抗体从红细胞上放散不完全。
③直接抗球蛋白试验阳性的红细胞，如新生儿溶血病患儿或自身免疫性溶血性贫血患者，经洗涤后即可作抗体释放试验。
④放散液中抗体易变性，故应分别进行鉴定。若要保存，应将抗体放散液于选定的AB型血清或牛白蛋白液中。
⑤如果需要检测放散后的红细胞血型，最好用45℃代替56℃，放散时间可以延长到15min。
3．乙醚放散法。
（1）标本：待检者血清。
（2）试剂：相应抗原的红细胞（抗凝血）、乙醚（分析试剂）、AB型血清。
（3）器材：试管、试管架、台式离心机、恒温水浴箱。
（4）操作步骤。
①取1份洗涤3次压积红细胞加1份生理盐水，2份乙醚，在专用振荡器充分震荡，然后以2000×g离心5min。
②离心后即分成3层，最上层是乙醚，中层是红细胞基质，下层是放散液，其色深红。
③用清洁吸管吸出放散液。
④将放散液置56℃水浴箱2～3min后，再置37℃水浴中30min，除尽乙醚，再次离心，然后鉴定抗体。
⑤结果判断。Rh血型抗体抗D为例，放散液和下列细胞反应（抗球蛋白法，其操作方法同不规则抗体鉴定时），CcdEE、CcdEe、ccdee细胞不凝集，CCDee、ccDEE、ccDee均发生凝集，证明该放散液中含IgG抗D抗体。
⑥注意事项。试验适用于鉴定Rh抗体，也可以用于检查获得性溶血性贫血，此种患者的红细胞为直接抗球蛋白试验阳性，说明在体内有自身抗体吸附。在红细胞上这种抗体常常有Rh特异性。
（十五）夫妇抗体效价测定标准操作规程
1．原理：孕妇IgG抗A（B）检测是预测新生儿溶血病发病的可能性及严重程度。人血清中的抗A（B）往往为IgM和IgG的混合物，它们具有相同的特性，要单独测定IgG抗A（B）必须去除IgM抗A（B）的干扰，使血清中的抗A（B）分解，剩下的IgG抗A（B）就能与相应的红细胞反应，从而检出IgG抗A（B）。
IgM分子由5个轴射状排列的亚单位组成，亚基间以二硫键相连，亚基间的二硫键比亚基内键间与链内二硫键容易被巯基试剂破坏，经巯基试剂处理后，IgM失去原来的血清学性质，常用的巯基试剂有二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇（2-Me）。
2．标本：夫妇不抗凝静脉血各3ml。
3．试剂：抗人球蛋白试剂，2-Me。
4．仪器：Baso血库专用离心机，37℃恒温水浴箱。
5．操作步骤。
（1）取丈夫不抗凝血3ml，妻不抗凝血3ml，正反定型夫妇ABO血型和RhD血型。
（2）妻血清100μl，加2-Me100μl，置室温30min。
（3）取试管8支并编号4、8、16……512，1～8管各加生理盐水100μl，第1管加2-Me处理后的血清100μl，倍量稀释至第8管，混合后弃去100μl，各管加3％～5％与丈夫ABO同型的新鲜红细胞悬液100μl。
（4）以3000r/min离心15～30s，肉眼观察试管中凝集强度，记录反应结果。
（5）将各管摇匀后置37℃水浴箱内30min。
（6）取出后用生理盐水洗涤3次，弃去盐水。每管加抗人球蛋白试剂1滴。3000r/min离心15～30s，肉眼观察结果。
（7）结果判断。第一管出现“±”凝集的稀释度，为被检血清中的抗体效价。当抗球蛋白介质凝集效价≥盐水介质凝集效价2管（4倍）时，可以认为抗球蛋白介质凝集效价即为IgG抗体效价。ABO系统效价≥64有意义。
6．注意事项。
（1）红细胞标本不能被细菌污染，否则出现假阳性。
（2）2-Me破坏IgM时间为37℃10min或室温30min，时间太短破坏不够完全，时间太长，2-Me会破坏所有二硫键的蛋白（包括IgG），致结果偏低。
（3）倍比稀释要准确，避免“跳管”现象。
（4）实验所用A（B）型红细胞最好用3人份新鲜A（B）型红细胞混合洗涤所得5%悬液，保证细胞新鲜，抗原稳定。
7．临床意义：当孕妇IgG抗A和（或）抗B效价≥64可认为有临床意义，当效价≥256或者检测到抗体效价持续升高4倍以上时，可认为胎儿受害的可能性大，应进行定期检测，必要时采取药物治疗。
（十六）母婴ABO血型不合新生儿溶血病检测标准操作规程
方法：直接抗球蛋白试验、游离抗体试验、患儿红细胞抗体释放试验（实验前先确定婴儿的ABO血型及RhD血型）。
方法一直接抗球蛋白试验1．原理。患者体内若有与红细胞抗原不相合的不完全抗体存在，可与红细胞结合形成抗原抗体复合物。但因不完全抗体分子量小，不能有效地连接红细胞，仅使红细胞处于致敏状态。加入抗球蛋白血清，与红细胞上吸附的不完全抗体结合，在致敏红细胞之间搭桥，出现肉眼可见的凝集。这种直接检测体内被抗体或（和）补体致敏红细胞的试验称之为直接抗球蛋白试验。
2．标本：EDTA抗凝静脉血2.0ml。
3．试剂。
（1）多特异性抗球蛋白试剂（IgG+C3d）。
（2）阳性对照：IgG型抗D致敏的5%RhD阳性红细胞生理盐水悬液。
（3）阴性对照：正常人5%红细胞生理盐水悬液。
（4）0.9%生理盐水。
4．仪器：Baso血库专用离心机、显微镜。
5．操作步骤。
（1）取EDTA抗凝全血标本于试管中，用生理盐水洗涤4～6次，取少量配成2%～3%红细胞生理盐水悬液。
（2）取上步配成的2%～3%红细胞生理盐水悬液1滴于试管中，加1滴多特异性抗球蛋白试剂，摇匀。
（3）阳性对照：IgG型抗D致敏的5%RhD阳性红细胞生理盐水悬液1滴，加多特异性抗球蛋白试剂1滴，摇匀。
（4）阴性对照：正常人5%D阳性红细胞生理盐水悬液1滴，加多特异性抗球蛋白试剂1滴，摇匀。
（5）受检管以及阳性、阴性对照管同时以3000r/min离心15～30s，轻轻振摇细胞扣观察结果。
（6）结果判断：先观察阳性和阴性对照管，阴性对照管无凝集，阳性对照管出现2+～3+凝集，说明检测管结果可信。如被检测管凝集，直接抗球蛋白试验阳性，不凝集者为阴性。如果实验结果阴性要加试剂对照细胞检查，对照阳性实验结果可靠。
6．注意事项。
（1）标本采集后应立即进行试验，延迟试验或中途停止可使抗体从细胞中丢失。
抗球蛋白血清应按说明书使用最适稀释度，否则可产生前带和后带反应而误为阴性结果。
（3）待检红细胞一定要用盐水洗涤3～4次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，以防止假阴性结果。
（4）全凝集、冷凝集血液标本或脐血标本Wharton胶，若洗涤不充分，血液标本中会有很多网织红细胞，另外，若抗球蛋白血清中含有抗转铁蛋白时，都可使红细胞产生凝集。
方法二游离抗体试验1．原理。新生儿血清中IgG抗A（B）来自母亲，如果在新生儿血清中发现有与其红细胞不配合的IgG抗A（B）时，应将其血清与标准的A、B和O红细胞反应加以证实。
2．标本：不抗凝静脉血2.0ml，以3000r/min离心3min，取上清液备用。
3．试剂。
（1）5%A、B、O型标准红细胞生理盐水悬液。