赵高的阴谋一步一步地实现了，他篡权夺位的条件也逐渐成熟了。现在，剩下的最后一个、也是最大的障碍，就是沙丘政变的同盟者李斯。自从沙丘政变之后，李斯一直是赵高心中的一块病。因为他知道赵高的一切阴谋，而且他本来就是反对政变的。他又是一个很有政治经验、位居丞相的人，随时都有可能除掉赵高，所以，必须先发制人，置李斯于死地。于是，他想出了一条借刀杀人的阴谋诡计。一天，他诡诈地对李斯说：“关东群盗蜂起，可皇上根本不把这事放在心上，反而急于征调役夫修筑阿房宫，采办聚敛那些狗呀马呀之类无用的东西。我很想劝谏他，可是自知人微言轻，恐怕起不了什么作用。这些其实是您当丞相分内的事，您为什么不去劝谏一下呢？”李斯不知是计，非常赞同赵高的意见，说：“本来我早就想进谏。可是现在皇上不上朝，居于深宫之中，很难找到进言的机会。”赵高见李斯上了圈套，就说；“如果您真想进谏的话，我给您留意着，等皇上一有空闲，我就来通知您。”两人约好后，于是赵高偏在二世拥姬挽妾，燕乐正浓时派人通知李斯，说：“皇上正有空闲，可以去奏事了。”李斯赶紧去进谏，结果引起了二世的反感。一连几次都是这样，惹得二世大怒，说：“我平常有很多空闲的日子，丞相却不来奏事，偏偏当我玩得高兴的时候，丞相就来奏事。莫非丞相以为我年轻好欺吗！”赵高乘机向二世进谗说：“丞相要是这么想的，那就危险了。丞相参与了沙丘之谋，现在陛下已做了皇帝，李斯的地位并没有提高，他的意思是想裂土封王啊！另外，还有一件事，今天陛下不问，我一直没敢说：丞相的长子李由为三川郡守，造反的陈胜等都是丞相邻县的人，这正是楚地强盗横行的缘由。陈胜的军队经过三川时，李由不肯出击。我听说他们之间还有文书往来，因为现在还没有拿到实证，所以一直没敢奏闻。况且丞相在外边的权力，比陛下还要大啊！”二世认为赵高说的有道理，想治李斯的罪，但没有证据，不好贸然行事，于是就派人去调查李由通贼的事。
后来，李斯得知了这件事，这才如梦初醒，知道上了赵高的当。他想面见二世，澄清赵高对他的诬陷，但二世在甘泉宫主嬉乐，拒不见他。于是李斯就改用上书揭发赵高是一个如同宋国的司城子罕、齐国的田常那样的弑君篡位，怀有“邪佚之志、危反之行”的阴谋家、野心家，并警告二世：“陛下不图，臣恐其为变。”（《史记·李斯列传》）二世完全不信李斯的上书，驳斥他说：“赵高虽然是个宦官，但他并不因为自己处境安逸而肆意妄为，也不因为处境危险而变心，他品行廉洁，善于自我约束，才取得了今天这样的位置。他是靠忠诚被提拔起来的，靠信义保住自己的职位的。所以，我认为他是一个贤能的人，而您为什么要怀疑他呢？而且先帝死后我还很年轻，缺少见识，又不懂得治理百姓，而您年纪又老了，如果没有赵高，恐怕我就会失掉天下的。我不把国家大事交给赵高，谁又能当此重任呢？况且赵高为人精明强干，对下能体察人情，对上能合我的心意，请您不必多疑。”李斯提醒二世说：“赵高并非如陛下所说。他本是一个‘贱人’，‘无识于理，贪欲无厌，求利不止，列势次主，求欲无穷’，这是一个危险人物。”（《史记·李斯列传》）秦二世已完全信任赵高，他怕李斯杀掉赵高，就把这事私下告诉了他。赵高乘机对二世说：“丞相所顾忌的就是我，我一死，丞相就会干出田常篡齐那样的事来。”赵高这一番恶毒的挑唆，使二世从根本上动摇了对李斯的信任，于是，他就把李斯交给赵高治罪。
赵高先把李斯拘捕起来，投入狱中。随即又把李斯的宗族、门客及凡与李斯有交往的人统统收捕归案。然后，赵高便用重刑逼供，要他招认与儿子李由谋反之情。李斯被鞭打一千余下，疼痛难忍，便招了假供。此时的李斯，还幻想着以雄辩之才，向二世上书自陈，企图以自己为秦所建立的功劳和实无反叛之心来打动二世，赦免自己。于是，他在狱中写了一封自辩书，托狱吏上达二世。然而，狱吏却把它送给了赵高。赵高一看，大发雷霆，把上诉书扯个粉碎，说：“囚犯怎么能上书呢！”
李斯的上书，反倒提醒了赵高：倘若二世真的派人来审问李斯，他肯定会翻供的。于是，赵高又想出了一条诡计：他让自己的门客10多人假扮成御史、谒者、侍中的样子，轮番去审讯李斯。李斯不知其中有诈，就以实情相告，结果每次都遭到残酷的拷打。后来，秦二世派人来核实李斯的供词，李斯以为又如前几次一样，始终没敢改口，承认了谋反的罪名。赵高把这份供词上奏给二世，二世看后非常高兴地说：“如果没有赵高，我几乎被李斯所卖！”
这时，二世派去调查李由通贼的使臣，也到了三川，这才知道李由已经被起兵反秦的项梁杀死。当使臣返回咸阳时，恰好李斯下狱，赵高把真实情况隐去，编造了一套假材料，蒙骗二世。这样一来，李斯便被定成死罪。二世2年（前208年）7月，处决李斯，把他腰斩于咸阳，并夷灭三族。临刑前，李斯凄楚地对他的二儿子说：“我们再也不能牵着黄狗出上蔡东门外去追逐狡兔了！”父子两人抱头痛哭。但这一切已悔之晚矣！
李斯死后，赵高被任命为丞相。因为他是宦官，可以出入宫禁，特称“中丞相”。“事无大小辄决于高”。再进一步，就是皇帝的宝座了！