《马关条约》签订后，中国民族危机加剧，于是出现了要求进行变法维新的声音。维新运动开始于1895年在北京发生的“公车上书”。当时齐集在北京参加科举会试的18省举人，得知《马关条约》中中国割去台湾及辽东，并向日本赔款两万万两的消息，一时间群情激愤。4月，康有为、梁启超作成上皇帝的万言书，提出拒和、迁都及变法的主张，1000多人签名。5月2日，康、梁二人带领18省举人及数千市民，集合在都察院门前要求代奏。因为外省举人到京是由朝廷的公车接送，事件亦被称为“公车上书”。虽然“公车上书”在当时没有产生直接实质的后果，但却形成了国民问政的风气，之后亦催生了各式各样不同的议政团体。当中由康、梁二人发起的强学会最为声势浩大，并曾一度得到帝师翁同龢、南洋大臣张之洞等清朝高级官员的支持。
光绪二十三年（1897年）年末，山东发生曹州教案，两名德意志帝国传教士被杀。德国乘机侵占胶州湾（今青岛），俄国同时进占旅顺、大连，法国进占广州湾（今广东湛江），英国进占山东威海，并要求拓展九龙新界。列强意图瓜分刚败于日本的中华帝国，在朝中再次敲响了警钟。
民族危机激发了光绪帝的爱国热情，公车上书启发了他变法的决心。他清楚地知道慈禧太后虽然已经撤帘，但是仍然紧紧控制着他。“上事太后谨朝廷大政，必请命乃行。”顽固的慈禧太后不会让他变法的，但是他决心已定，为了国家的振兴，他把个人的利益和荣辱置之度外，说：“太后若不给我事权，我愿退让此位，不甘做亡国之君。”他用手中的权力极力支持康有为。光绪二十四年（1898年，戊戌年）四月十三日，御史杨深秀奏请定国是，面对列强瓜分的危险，慈禧太后同意光绪帝进行朝政的改革。二十三日，光绪帝颁布“明定国是诏”，在政治、经济、军事、文教诸方面实行变法，旨在挽救中国危亡。他对维新派主要人物作了恰当的人事安排，允许康有为专折奏事，并任命他在总理衙门章京上行走，以便上奏，提出变法方案。在短短的103天里，光绪帝颁布了100多条新政上谕。
新政内容主要有：裁汰冗员、废八股、开学堂、练新军、满汉平等……涵盖教育、军事等多方面的政策和体制。其最终目标，是推行君主立宪制。康有为向光绪帝赠送自己的著作《日本变政考》和《俄罗斯大彼得变政记》，还有李提摩太的《泰西新史揽要》的译本和其他有关各国改革的书。
光绪帝发布御令，企图形成自上而下的全国改良性运动，但遇到大多数地方顽固势力尤其是慈禧太后的阻挠和破坏。两江总督刘坤一、两广总督谭钟麟根本不理睬御令筹办之事，电旨催问，也置若罔闻。慈禧太后表面上同意变法，实际上想方设法阻挠变法。她发出懿旨，迫使光绪帝将变法中坚人物翁同龢革去协办大学士、户部尚书职务，同时任命“后党”重要人物荣禄为直隶总督，掌握兵权，又规定新任职的两品以上的文武官员向她谢恩，目的是拉拢“帝党”。
光绪帝对此作了针锋相对的斗争。他革去了守旧、阻挠上书的怀塔布、许应揆等6名礼部堂官，任命了7名新堂官，其中4名是支持维新的。七月二十日，光绪帝又任命维新派重要人物江苏候补知府谭嗣同、刑部候补主事刘光第、内阁候补侍读杨锐、内阁候补中书林旭担任四品衔章京，处理新政事宜。
慈禧太后决意破坏变法，发动政变。她授意荣禄调兵遣将，聂士成部驻天津陈家沟，董福祥部驻北京长辛店。翰林院编修李盛铎奏请光绪帝奉慈禧太后去天津阅兵，以乘机胁迫光绪帝让位。
七月三十日，光绪帝密诏杨锐，告以危局，命与林旭、刘光第、谭嗣同等速议对策。鉴于光绪帝处境危险，谭嗣同于八月初三夜访在天津训练新军的袁世凯，要求他举兵杀荣禄，围颐和园以救光绪帝。袁世凯慨然应允，但当晚就密报荣禄。
不知情的光绪帝于八月初五还召见袁世凯，袁世凯建议他召张之洞襄助。
八月初四，康有为访英国传教士李提摩太，请英国公使相助，未应允。两日后，袁世凯回到天津，将谭嗣同的计划向荣禄报告。八月初四，慈禧太后回宫，八月初六即临朝，宣布戒严，火车停驶；随即幽禁光绪帝，废除新政，搜捕维新党人。
由慈禧发动的戊戌政变，结束了只有103天的维新。慈禧太后第三次训政；康有为、梁启超逃往国外，张荫桓戍边，徐致靖永禁，杨深秀、杨锐、林旭、刘光第、谭嗣同、康广仁（康有为之弟）处斩。维新举措，除京师大学堂外，一律都被废止，戊戌变法失败。
光绪帝支持康有为、梁启超等人实行的戊戌变法，是中国历史上第一次资产阶级改良运动，历时虽不长，但动机良好，虽败犹荣。光绪帝是晚清最有见识，并且能为国家利益不顾个人安危的皇帝，他的名字与这场运动青史永垂。
但是慈禧太后对光绪非常不满，认为光绪从4岁进宫，自己费心抚养成人，却这么不听话，搞什么戊戌变法来蛊惑人心，于是就想废掉他，另立皇帝。当初光绪皇帝即位时，两宫太后曾经说过，等将来光绪帝有了儿子，再过继给同治帝载淳为嗣。但光绪无子，怎么办？废帝后，光绪又该怎么处置？慈禧反复思考这两个难题。
光绪二十五年（1899年）十一月二十八日，上完早朝之后，慈禧单独召见荣禄。慈禧与荣禄商量着立一个大阿哥，作为同治和光绪帝的继承人。此时，端郡王载漪之子溥俊进入了慈禧的视线。15岁的溥俊处在爱新觉罗氏（父系）与叶赫那拉氏（母系）两支血缘的交叉点上，慈禧觉得很满意，便将其召入宫内，立为大阿哥，打算让他取代光绪。但外国公使并不承认这位大阿哥，理由是他的父亲爱新觉罗·载漪是义和团领袖。慈禧太后不顾反对，她想让溥俊于四月即位，改元保庆，废黜光绪皇帝，并且由慈禧太后垂帘听政。朝野上下引起轩然大波。慈禧被迫停止废除光绪的计划。