19岁的袁世凯是中国驻高丽总督吴长庆手下一名小分统，马相伯和吴长庆原有旧交，又是高丽政治顾问。袁世凯对比他大19岁的马相伯十分恭敬：“马顾问，有什么捷径可以飞黄腾达？”马相伯便寻开心道：“只有厚赂宦官，由宦官结纳亲贵，便可越级而升，做抚督也不难。”袁世凯信以为真，如法炮制，居然生效，几天后见到马相伯十分高兴，他说：“您的办法真灵光，你见事如此透澈，代我筹划，又如此奇效。为什么自己不这样做呢？”马相伯感到好笑：“我这个人只会讲，不会做，所以终生是穷书生嘛！”
有一次，袁世凯将一份重礼送给马相伯，请马相伯在吴总督处走走路子，提拔他。马相伯办事是一板一眼的人，连忙回绝：“这事万万通融不得，你对国事应多忠诚，做官忌心切。”“马顾问不必当真，我是说说笑笑而已。”袁世凯厚着脸皮，笑吟吟地离开。马相伯拿着手上的礼品：“这礼品你带回去，我不能接受。”“马顾问，这是我的一点小意思，不妨留着。”袁世凯急忙走了门外。马相伯拎着礼品，喉咙高了一倍：“你再不拿走，我就掷出门外。”
袁世凯无奈，只好接回礼品，悻悻离开了，他就到吴长庆面前挟嫌诬告：“吴总督，马顾问这人，官仪不检。”吴长庆皱着眉头：“你怎么能谄诬马顾问。”“马顾问在公署挟妓女饮酒睡觉。”“此话当真？”“是我手下人亲眼所见。”吴长庆为人正派，生平最恨此事，就对袁世凯说：“本官自会处理，你先别声张。”第二天清晨四点多钟，吴长庆独自一人，来到马相伯的住处，直入卧室，看见马相伯在榻上独眠，没见什么妓女，也放下心来。马相伯听见声响，见是吴长庆忙起身道：“吴总督起得这么早，为什么不事先通知一声。”“没什么事，出来转转，你睡，你睡。”吴长庆含糊其辞地离开。
后来，马相伯得知吴长庆因袁世凯打的小报告而来，一笑了之，也没往心上去。当他回国述职时，袁世凯又再三缠着马相伯说：“顾问大人，请在李中堂处为小弟多说几句，举荐一下。”马相伯没有计较袁世凯以前的诬告之事，说：“好吧，我尽力举荐。”
马相伯回国后，向李鸿章介绍了朝鲜的有关情况。“马公，可有什么合适的做朝鲜商务委员？”李鸿章询问马相伯便接口道：“袁世凯这人有点本事，对朝鲜情况也有点熟悉，李伯相，就派袁世凯担任如何？”李鸿章一时也没有适当人选，又是马相伯的举荐，就派袁世凯为清廷驻朝鲜的商务委员。可袁世凯做了驻朝商务委员，任意侮辱高丽君臣，这样促使高丽倾向日本，而爆发了中日之战。
袁世凯对马相伯出于感恩和推崇，在1912年窃取中华民国临时大总统职位后，礼聘马相伯为最高顾问。马相伯反对袁世凯改共和为帝制，一次，袁世凯和马相伯闲谈时问：“人民不知敬事长上，国家何以安？天下何以治？”马相伯吃透他想当皇帝的心思，不紧不慢地说：“你所指的是一种磕头请安才能表现出敬事长上吗？如果这样便能安邦定国，平治天下，那么老夫愿意从今天开始，朝叩一头，晚多一拜，日日不懈，为天下倡。”袁世凯只好尬尴地点点头。
袁世凯命长子袁克定设宴邀请马相伯和严复，征求意见。马相伯坦率地说：“袁总统真要称帝，也得不到国民的拥护，一定会遭到反对，就是这点暂不考虑，可是外交方面，也会遭到强国藉口，百端要挟，以遂其大欲。这样连锁反应，势必引起国内全体国民声讨，弄得不可收拾，以我看还是打消这种想法吧！”袁克定称是。第二次设宴，袁克定欣然相告，外交已无问题，日本方面表示赞成。马相伯看已到了口舌所不能挽回的地步，便想辞官南下。
1915年7月，马相伯任宪法起草委员会委员，袁世凯亲自祭天祭孔，提倡“尊孔读经”，袁氏党徒在宪法中规定孔教为国教，为复辟帝制造舆论，马相伯大加反对，著有《一国无首应兼主祭主事否》、《宪法草案大二毛子问答录》、《保持约法上人民自由权》等文，并为各区教会代拟五篇请愿书，以信仰自由为理由，驳斥尊孔教为国教和以“孔子之道为修身大本”的主张。
袁世凯不顾国人的反对，做了“中华帝国”皇帝。临朝时，文武百官齐叩首，只有马相伯站立不拜。袁世凯没办法，只好搬张椅子给马相伯坐下。马相伯为反对袁氏帝制，辞职准备南归。但是袁世凯却不放过他，在马相伯住宅四周，都派密探。
马相伯就在密探不注意时，化装成一个买菜的老家人，带了竹篮子只身逃出了北京城，到上海住了下来。他发表《国民照心镜》一文二万余言，痛斥袁世凯称帝之罪，表达他主张共和政治的卓见。他对朋友说：“袁世凯把我戏谑之言，奉为做人的科律，而民国竟以此人为开国总统，国事又安可问耶？百复辟，百复亡。”袁世凯身败名裂，一命呜呼时，马相伯叹道：“袁世凯对国事本无忠诚，做官心切，皆私字一念害之，当日我推荐他当驻朝鲜通商大臣，也不能不咎其咎。”