1923年，陈鹤琴在东南大学教育科任教，讲授儿童心理学。为了推行适合中国国情的幼儿教育，他创建了“南京鼓楼幼稚园”，作为理论研究的实验园地。他以自己的住宅为园舍，招收幼儿12名，自任园长。第二年加以扩建，邀请东南大学教授涂羽卿、陆志韦、董任坚、张子高和甘梦丹民组成董事会，邀张宗麟协助搞研究工作，还购地建筑新园舍。这样，鼓楼幼稚园就成为我国第一所幼稚教育实验中心。
鼓楼幼稚园试验的课程有关于教具、教材、教法等方面的内容，还有幼稚生应有的习惯和技能的培养方法等。试验的结果成为国民政府教育部1932年颁布的《幼稚园课程标准》的基础。
陈鹤琴为深入研究和推广适合中国国情的幼儿教育，从1927年起支持陶行知筹创晓庄试验乡村师范学校，并兼任该校指导员及第二院（幼稚师范院）院长，又与陶行知合力创办樱花村幼稚园，开辟了乡村幼稚教育实验场地，从事中国乡村幼稚教育的实验和乡村幼稚园的工作，还与当地人士开办了不少乡村幼稚园。
陈鹤琴还与陶行知、张宗麟等发起组织幼稚教育研究会，出版幼稚教育刊物。他主编《幼稚教育》月刊，在创刊号上发表了《我们的主张》一文，提出适合我国国情和儿童特点的15条办幼稚园的主张。他还倡导“凡儿童自己能够做的，应当让他自己做”，“凡儿童自己能够想的，应当让他自己想”，“凡儿童能够学可以学的，应当教他学”等原则。
1927年，陈鹤琴受聘任新建立的南京特别市教育局学校教育科科长，成为教育局局长陈剑脩的助手，参与领导和管理全市中小学校的教育工作。陈剑脩是一个知名学者，具有民主作风。他完全信任陈鹤琴，放手让他工作。于是陈鹤琴开始了新的计划，即在全市建立儿童教育实验区。国外尤其是欧洲教育学者进行类似实验的不乏其人，但如陈鹤琴这样以一个大城市为实验基地，进行大面积的儿童教育实验是绝无仅有的。
陈鹤琴为提高各小学校长的办学水平，常率领他们到晓庄学校及其所办的乡村小学观摩见习，学习陶行知的教育思想和方法，培养了不少有思想、有能力的小学校长，成为南京地方教育界的支柱。
虽然当时南京市的教育经费不足，而且时有亏欠，但一些小学校长在陈鹤琴领导下努力工作，朝气蓬勃，团结合作，创造出教育界前所未有的新风气和新局面。
1929年，陈鹤琴同陶行知合作，以南京五区实验学校为基础，发起建立中华儿童教育社。总社设在南京府西街市立中区实验学校内（今南京市第一中学所在地）。陈鹤琴是该杜的理事长。社员有团体与个人两种，个人社员以上海、南京两地人为多。到1937年，发展到全国21个分社，四千多社员，成为当时全国最大的教育学术团体之一，是我国研究和推动儿童教育的中心。
陈鹤琴曾请陶行知作了中华儿童教育社社歌。这个社歌体现他在儿童教育上的一贯主张。歌中所谓“发现小孩”、“了解小孩”、“解放小孩”、“信仰小孩”、“变成小孩”，才能教育小孩，是一套完整的儿童教育原则。
中华儿童教育社在抗日战争前先后举行了七届年会，其中以1932年11月11日在南京召开的年会规模最大。当时，陈鹤琴是大会主席团主席。他在会上宣读了《心理与心理卫生》论文。由于那次年会的影响，南京市卫生局和教育局组织了一个学校健康教育委员会。同时，卫生局还在中区实验学校设立了一个南京市医疗中心卫生室，负责对全市小学师生进行医疗和健康教育。
新中国成立后，陈鹤琴回到阔别多年的南京，任南京师范学院（现南京师范大学）院长。
1959年陈鹤琴受到错误批判，被调离教育岗位。十年浩劫中又遭到折磨，但他没有动摇对党和社会主义的坚定信念，没有改变他对祖国、对儿童的热爱。他是全国政协委员、江苏省人大常委会副主任，在人大和政协工作中发挥了积极作用。
1982年12月，陈鹤琴因病逝世，终年91岁。江苏省人大常委会在为他作的悼词中说：“陈鹤琴同志从事教育工作一生中，特别对创办和发展我国的幼儿教育事业，研究儿童心理和师范教育等方面做出了重要贡献。”“他是中国著名教育家和幼儿教育家。”他为中国的幼儿教育事业，特别是南京的教育事业，奋斗了一生。