大球盖菇菌种和其他食用菌菌种一样共分三级，即母种、原 种和栽培种。可用组织分离法和孢子分离法等获得纯菌种， 也可以引进母种或原种。母种的制作过程：第一步，选配方 ，配制母种培养基；第二步，高压灭菌；第三步，菌种分离 ；第四步，母种扩接。母种培养基配方主要有普通马铃薯葡 萄糖琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基、麦芽糖酵母琼脂培养 基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基和燕麦粉麦芽糖酵母琼脂培养 基等。
普通马铃薯葡萄糖琼脂培养基（简称PDA培养基）：马铃薯（ 去皮）200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1 000毫升。
马铃薯蔗糖培养基：马铃薯（去皮）200克，蔗糖20克，硫酸 镁0.5克，磷酸二氢钾1克，氯化钙0.1克，琼脂20克，水100 毫升。
麦芽糖酵母琼脂培养基（简称MYA培养基）：大豆蛋白胨（豆 胨）1克，酵母2克，麦芽糖20克，琼脂20克，水1 000毫升。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（简称PDYA培养基）：马铃薯300克 （去皮，加水2 000～3 000毫升，煮2小时），酵母2克，大 豆蛋白胨1克，葡萄糖10克，琼脂20克，水加至1 000毫升。
燕麦粉麦芽糖酵母琼脂培养基（简称DMYA培养基）：燕麦粉 80克，麦芽糖10克，酵母2克，琼脂20克，水1 000毫升。