书城医学动物疫病实验室检验技术
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第16章 常用试剂的配制(3)

八、无钙、镁磷酸缓冲液:使用液(pH7.3)

NaCl 8.0g

KCl 0.2g

Na2HP041.15g

KH2P040.2g

去离子水1000ml

配制方法:按上述次序将各成分在去离子水中溶解;分装,高压灭菌;室温或4℃贮存。

九、Tris(三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)Aminomethane])缓冲液此缓冲液用在少用或不用NaHCO3的细胞培养中,其优点在于可不必用CO2培养箱,pH范围在7.0~9.0(7.5~8.5最稳定),低于7.0以下无效。经过改良的Gey氏盐溶液将Tris制备成0.05mol/L(pH7.6)的母液,使用时最终浓度为0.002~O.O2mol/L。

Gey氏溶液:A液:NaCl 70.Og

KCl 3.7g

NaHP041.19g

KH2P040.372g

葡萄糖10.0g

1%酚红10.0ml

去离子水990ml

按上述次序在去离子水中溶解各种成分,此即为10倍浓缩母液,4℃贮存,用时用去离子水稀释10倍,高压消毒,室温或4℃贮存。

B液:MgCl2·6H200.42g

MgS04·7H200.14g

CaCl20.34g

去离子水100ml

配制方法:依次在去离子水中溶解各成分;高压消毒;室温或4℃贮存。

0.05mol/L Tris缓冲液的制备:取20ml B液加到360ml A液中,即为改良的Gey氏溶液;取2.42g Tris溶解在约100ml的上述溶液中;加76.8ml 0.2mol/L HCl到(2)中(O.2mol/L HCl需事先配制);加(1)到(2)中,使总量到400ml,此即为0.05mol/L Tris缓冲液,pH7.6;过滤除菌分装,4℃贮存。

十、水解乳蛋白液

制备5%母液:水解乳蛋白50g

无NaHPO4的Hank‘s使用液1000ml

配制方法:将水解乳蛋白加到Hank’s溶液中,加热到56℃直至溶解;分装,高压灭菌;室温或4℃贮存;用前将50ml此溶液加入lml的lmol/L NaOH溶液中和。

十一、胰酶(Trypsin)

0.25%溶液:胰酶2.5g

Hank‘s使用液1000ml

青霉素10ml

链霉素10ml

配制方法:加胰酶和抗菌素于Hank’s液中,震荡使其溶解;加压过滤除菌,分装,-20℃冰冻贮存;一瓶最好一次用完,不宜反复冻融。

十二、胰酶-乙二胺四乙酸二钠(Trypsin-Versene)

胰酶2.5g

乙二胺四乙酸二钠(Versene)0.2g

无钙镁磷酸缓冲液1000ml

青霉素10ml

链霉素10ml

配制方法:加胰酶,乙二胺四乙酸二钠和抗生素于无钙镁磷酸缓冲液中震荡使其完全溶解;加压过滤除菌,分装,-20℃冰冻贮存;一瓶最好用一次,不宜反复冻融。

十三、乙二胺四乙酸0.02%溶液(Versene,pH7.3)

乙二胺四乙酸0.2g

无钙镁磷酸缓冲液1000ml

配制方法:将乙二胺四乙酸溶解于无钙镁磷酸缓冲液中;分装,高压消毒;放4℃保存。

十四、谷氨酢酰胺溶液

L-谷氨酰胺12.Og

配制方法:溶于400ml去离子水中;加压过滤除菌;分装成50ml;-20℃贮存。

此液不加在母液里,在配使用液(即生长液或维持液)时加入。

十五、细胞冷藏保存液

10倍Eagle‘s母液80ml

灭菌去离子水702ml

谷氨酰胺溶液8ml

4.4%NaHC0310ml

小牛血清100ml

甘油(高压灭菌或用10%二甲基亚砜)100ml

青霉素10ml

链霉素10ml

配制方法:用无菌操作法依次加入上述试剂;分装,堵紧瓶塞,4℃贮存。

十六、血清

组织培养用的血清种类很多,其中有小牛血清、胎牛血清、马血清、兔血清、人血清等,一般从已禁食24h的动物血液分离获得。如用小牛血清则以不吃过母乳的小牛为佳。

配制方法:无菌操作采皿,室温凝固;从玻璃瓶壁剥离血块,在4℃冷过夜,使血块尽量收缩;吸出血清,离心沉淀,3000r/min,15min;收集上清加压过滤除菌;分装,56℃30min加热(有时也可不灭活);-20℃冰冻贮存,每瓶血清最好一次用完。

十七、pH调整液

在许多情况下,为了营养成分稳定和延长贮存时间,配制溶液时,都不预先加入NaHCO3,而在使用前加入。为了保持培养pH恒定,以利于细胞的生长和增殖,还可用HEPES[N-(2hydroxyethl peperazine-ethanesulphonicacid)]作添加剂。

1.NaHCO3常以浓度为7.5%,5.6%和3.7%三种调整pH值。用灭菌去离子水(或双蒸水)配制,分装,4℃保存。当pH值超过后,可用高压灭菌的10%醋酸溶液或通入CO2调节。

2.HEPES 为了能在较长时间控制恒定的pH值范围,可以使用氢离子缓冲液。HEPES就是其中的一种,它具有较强的缓冲能力。使用最终浓度为10—5m mol/L,可根据缓冲能力的要求而定。

3.HEPES的配制HEPES可按照所需的浓度,直接加入到配制的培养液中,再过滤除菌。通常配制成500m mol/L的浓度。用200ml双蒸水溶解47.6g HEPES,用lmol/L NaOH调节pH至7.5~8.0。过滤除菌后,分装,4℃保存。

第四节血清学试剂的配制

一、阿氏(Alsever’s)液

葡萄糖2.05g

枸椽酸钠0.8g

枸椽酸0.055g

氯化钠0.42g

去离子水加至100ml

上述成分混合后加微热溶解,过滤,以0.053MPa 20min灭菌,4℃贮存备用。

二、钙镁盐水

MgCl2·6H2010.0g

CaCl2·2H204.0g

.加去离子水至100ml

取上述钙镁溶液lml加入生理盐水999ml即为钙镁盐水,用于补体结合试验。

三、0.5mol/L碳酸缓冲液(荧光技术用)

NaC03(无水)0.6g

NaHC033.7g

去离子水加至100ml

测pH,并按需要将pH调至9.0—9.5,保存中要塞紧瓶塞,用前配制。

四、pH7.2磷酸缓冲盐水(PBS)

Na2HP040.56g

KH2P040.14g

NaCl 8.5g

去离子水加至1000ml

0.112Mpa高压灭菌30min后备用。

五、pH 9.0硼酸盐水(用于血凝试验)

母液甲(1.5mol/L NaCl液):

NaCl 87.68g

去离子水加至1000ml

母液乙(O.5mol/L硼酸):

H3B0330.92g

去离子水加至1000ml

母液丙(1mol/L NaOH溶液):

NaOH 40.0g

去离子水加至1000ml

配制0.05mol/L H3B03~0.12mol/L NaCl pH9.0的硼酸盐水:

母液甲80ml

母液乙100ml

母液丙24ml

去离子水加至1000ml

六、巴比妥缓冲盐水

NaCl 85g

5,5-二乙巴比妥酸5.75g

5,5-二乙巴比妥酸钠盐3.75g

MgS04·7H202.08g

CaCl2·2H2039.2g

去离子水加至2000ml

先将酸溶于500ml热去离子水中,再加其他成分,最后加水至2000ml,

0.112MPa20min灭菌,保存于4℃,pH为7.2,用前取上述原液1份再加去离子水4份稀释之。

七、免疫佐剂

10号白油9份

司本80(speen 80)1份

煮沸溶解、灭菌15~20min后,冷却,放4℃备用。

也有在使用时加入吐温-80(Tween-80),使最终浓度为1%。

第五节组织学和细胞学试剂的配制

一、固定液

1.Bouin氏固定液

1.2%(饱和)苦味酸水750m1

甲醛溶液(40%HCHO)250ml

冰醋酸50ml

配制方法:按上列顺序依次加入,室温保存。

使用方法:固定组织1~2天;在70%~80%乙醇中洗2~3天,每天换液一次;组织在70%乙醇中保存。

备注:此液渗透力强,对组织固定均匀,收缩较小,染色效果好,为常用的固定液。

2.Carnoy氏固定液

氯仿300ml

无水乙醇600ml

冰醋酸lOOml

配制方法:按顺序加入,混匀,室温保存。

使用方法:固定小块组织2~3h,固定后直接转入无水乙醇脱水即可。

备注:此液浸透快,固定时间不宜过长,经其固定的组织块,甲绿-派洛宁染色显示DNA、RNA较好。

3.Zenker氏固定液

氯化汞70g

硫酸钠10g

次氯酸钾25g

去离子水1000ml

配制方法:将上述盐类溶于水中(加温);室温保存;用前加冰醋酸使最终浓度为5%。

使用方法:切组织块(厚3~4mm),依组织块大小固定6~18h,用自来水冲洗过夜或每1~2h换水一次,共2~3次,组织保存于70%乙醇中。

备注:此液固定的组织,细胞核与细胞质的染色较清晰,也较稳定。

4.10%甲醛溶液生理盐水固定液

NaCl 8.5g

甲醛溶液(37%~40%甲醛)100ml

去离子水900ml

配制方法:将NaCl溶于水后,加入甲醛溶液,室温保存。

使用方法:将组织在固定液中浸lO~15min。

备注:此液实际上只有4%的甲醛。

5.PLP固定液

0.2mol/L赖氨酸450ml

0.1mol/L PBS(pH7.5)450ml

8%仲甲醛(Paraformaldehydye)300ml

过碘酸钠257g

配制方法:用蒸馏水配制0.2mol/L赖氨酸溶液,并用0.1mol/L Na2HPO4调pH至7.4;用0.1mol/L PBS将0.1mol/L赖氨酸溶液稀释1倍;加8%仲甲醛水溶液。赖氨酸-PBS:仲甲醛=3:1,赖氨酸终浓度为0.075mol/L,仲甲醛为2%;加入固体过碘酸钠,使其为0.01mol/L。

备注:此液常用作免疫电镜的组织固定剂。

二、染色液

1.吖啶橙(Acridine orange)

甲液(1%柠檬酸):柠檬酸lg

去离子水100ml

将柠檬酸溶于水中,室温保存。

乙液(1%吖啶橙):吖啶橙lg

去离子水100ml

将吖啶橙溶于水中,室温保存。

丙液(柠檬酸-磷酸盐缓冲液,pH4.95):

O.1mol/L柠檬酸溶液:柠檬酸19.2g

25%甲醇溶液1000ml

0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:NaHP0428.4g

25%甲醇溶液1000ml

配制方法:将棕檬酸和磷酸氢二钠分别溶于25%的甲醇溶液中;两液等量混合即得pH4.95柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液;瓶塞盖紧,室温保存。

使用方法:将盖玻片上的培养物用磷酸缓冲盐水洗3次;Carnoy‘S固定液中固定15s;95%乙醇中2min;70%乙醇中2min;50%乙醇中2min;30%乙醇中2min;1%柠檬酸缓冲液泡片刻;去离子水中漂洗;转到柠檬酸—磷酸盐缓冲液(pH4.95)中5min;吖啶橙溶液中染色5min(用pH4.95的柠檬酸-磷酸盐缓冲液将吖啶橙配成0.01%~0.001%浓度);在缓冲液中漂洗5min;裱贴于载玻片上;

在暗视野紫外线显微镜下观察,DNA发黄色荧光,RNA发火红色荧光。

备注:应用此液作细胞化学染色法,可显示RNA和DNA,它能区别病毒核酸是双链(黄绿色)还是单链(橘红色)。

2.姬姆萨染色:

姬姆萨染料0.5g

甘油33ml

甲醇33ml

配制方法:把姬姆染料加到甘油中,加热到56-60℃1h,保持震动;加入甲醇室温中放置24h,保持摇动;用滤纸过滤,滤液即为原液;盖紧瓶塞,室温保存。

使用方法:将制备的涂片干燥,在姬姆萨固定液中固定5min;转到盖紧的染色缸内(在缸内事先装1份姬姆萨原液,加49份中性去离子水),把载玻片反过来以免沉淀沉积在标本上。密封,37℃培养过液;在去离子水中清漂若干次,用吸水纸吸干;放入纯乙醇中分化;用去离子水清漂一次,并使干燥;用中性香胶封固。原生小体染成紫色。

备注:几乎所有的原生小体都可用此法染色。

3.Feulgen染色

Schiff试剂:碱性复红(Basic fuchsin)1.Og

焦亚硫钾(K2S205)20g

活性炭适量

1mol/L HCl 20ml

去离子水200ml

配制方法:煮沸水,加入碱性复红;冷到50℃,用滤纸过滤;加lmol/L HCI,冷却到室温;加焦亚硫酸钾,放置过夜;如第二天不呈淡黄色,加入约0.5g活性炭,摇动lmin后用滤纸过滤;保存于4℃,此试剂一直可用到转粉红色为止。