第6章 丙型肝炎的发病机制 (2)
非溶细胞方式抗病毒过程主要是通过分泌一系列细胞因子（主要是IFNγ和IFNα）来完成的。细胞因子的作用范围非常广泛，它们可以诱导细胞表达抗病毒基因从而产生抗病毒分子；同时在细胞因子的趋势或诱导分化作用下，在感染局部产生一个适宜于抗病毒的微环境。对其他病毒（包括HBV）感染后发病机制的研究显示，机体清除病毒的主要途径是非细胞溶解方式。多数学者认为IFNγ在这一过程中起非常重要的作用。但是慢性HCV感染者肝内也可检出大量IFNγ，并且IFNγ表达量与HCV RNA滴度之间无相关性。因此对于IFNγ在HCV清除过程中的作用及其他细胞因子的功能仍有待进一步研究。
强有力的CD+8T淋巴细胞免疫反应也是成功清除病毒的重要因素。自限性HCV感染者，感染后4~8周可检测出针对多抗原的强烈的CD+8T淋巴细胞免疫反应。大多数研究结果均显示，早期强有力的、针对多抗原表位的CD+8T淋巴细胞免疫反应是急性HCV感染的标志；而慢性感染者在HCV感染早期CD+8T淋巴细胞反应微弱，针对的抗原表位较少。对自限性HCV感染者的研究结果显示，CD+8T细胞识别的表位可多达12个。黑猩猩研究也得出类似的结果，识别的表位在9个左右。但是也有研究结果显示HCV特异性CD+8T淋巴细胞与HCV感染结局无关。Urbani等对6名自限性HCV感染者和11名持续性HCV感染者进行对比分析后，发现前者比后者有更强烈、针对抗原更广泛的CD+4T淋巴细胞反应，但两组患者CD+8T淋巴细胞反应无差别。
三、 HCV感染与细胞凋亡
1.细胞凋亡细胞凋亡（Apoptosis），即程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。一般是指机体细胞在发育过程中或某些因素作用下，由于生理或病理原因，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种主动程序化细胞死亡过程。细胞凋亡的形态改变是多阶段的，首先是细胞缩小，胞质凝缩，内质网疏松并和胞膜融合，核糖体、线粒体等聚集，但结构无明显改变。染色质逐渐凝集成新月状，附在核膜周边，嗜碱性增强，以后细胞核固缩成均一的致密物，进而核碎裂，胞膜完整。继之核膜出芽，固缩染色质脱落，形成膜包凋亡小体。最终凋亡小体被周围吞噬细胞吞噬降解。
凋亡因子的正确表达是维持组织代谢平衡、避免自身免疫性疾病和肿瘤的必要条件。然而凋亡因子的过度表达又可导致组织受损，甚至器官功能衰竭。慢性丙型肝炎的病理表现主要是炎细胞浸润、肝细胞损害、纤维组织再生。如病情进展，最终发展成为肝硬化及原发性肝癌。肝细胞损害是疾病进展的必要条件，造成肝细胞损害的原因很多，细胞凋亡是其中之一。如前所述，细胞凋亡不同于细胞坏死，它没有细胞膜的破坏，因此也就没有细胞内物质向外扩散，临床上表现不出炎症的特点。有人推测慢性丙型肝炎患者T淋巴细胞凋亡增加，是细胞免疫功能受损的原因之一。
诱导细胞凋亡主要有两条途径：①细胞外或死亡受体（death receptor，DR）途径；②细胞内或线粒体途径。前者是由于细胞膜受体被结合或寡聚化后引发凋亡。肝细胞表面表达DR可能是清除受染病毒的需要，免疫细胞可通过凋亡途径来杀死受染的肝细胞。相反，细胞内或线粒体途径凋亡的起动因素在于细胞内部，通常是由于细胞内DNA受损、细胞内钙离子浓度的变化等。两种致凋亡途径可同时存在。胱天蛋白酶（caspase）贯穿了这两条途径的始终。现已发现的胱天蛋白酶有14种，通常是以酶原的形式存在于细胞中。其中６种在细胞凋亡过程中起重要作用，即胱天蛋白酶3、6、7、8、9、10。并根据作用的不同分为两组：①效应胱天蛋白酶，包括有胱天蛋白酶３、６、７，主要负责切割某些蛋白质；②启动胱天蛋白酶，包括有胱天蛋白酶８和９，主要作用是启动并激活胱天蛋白酶的级联反应（caspasedependent apoptosis cascade）。
线粒体功能障碍是加速细胞凋亡过程的重要因素，也起到整合DR通路和压力信号（stress signals）到共同最终通路的作用。线粒体释放细胞色素C是凋亡早期普遍存在的现象，诱导凋亡最终的胱天蛋白酶依赖的凋亡级联反应。细胞表面的DR属于细胞因子超家族肿瘤坏死因子和神经生长因子（TNF/NGF），它表达于包括肝细胞等多种组织细胞表面。由DR诱导的细胞凋亡在多种生物过程中起重要作用，例如维持免疫系统淋巴细胞数量和比例的稳态，以及保护机体抵抗外来微生物感染等。
目前发现的DR有6种，但在肝损害中起作用的有以下四种：①Fas（CD95）；②肿瘤坏死因子受体1（Tumor necrosis factor receptor1，TNF-R1）；③肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体1（TRAIL-R1），也称为DR4；④肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体2（TRAIL-R2），也称为DR5。这些受体的细胞膜内部分有60~80个氨基酸序列，被称为死亡结构域（death domain）。其作用是结合相应蛋白，将外来信号转入细胞内触发凋亡级联反应。
Fas是一种细胞膜蛋白质，分子量42~52kDA，当它与FasL结合时便会诱发凋亡过程。FasL是表达在激活的T细胞和NK细胞表面的跨膜蛋白，有一个共同的三聚体结构。Fas系统功能障碍通常会表现为淋巴系统和肝增生，致自身免疫性疾病或致肿瘤的发生；而Fas系统功能亢进则导致组织的损伤。FasL在肝内T淋巴细胞表面表达增多，因此有利于诱导肝细胞凋亡。
在感染性或炎症反应条件下，肝内Kupffer cells、单核细胞、T细胞、B细胞及肝细胞内产生大量TNF-α。TNF-α是一种Ⅱ型跨膜蛋白，其受体分两种：TNF-R1和TNF-R2。只有TNF-R1的细胞内存在有死亡结构域，可起动凋亡过程。
TRAIL/APO-2也是一种Ⅱ型跨膜蛋白，通过裂解变成水溶性。有生物学活性是其三聚体形式，利于结合相应的受体。TRAIL/APO-2受体有五种：TRAIL-R1，TRAIL-R2，TRAIL-R3（也称作TRID），TRAIL-R4和可溶性骨保护素受体（the soluble osteoprotegerin receptor，OPG）。其中只有TRAIL-R1和TRAIL-R2含细胞内死亡结构域。
2. DR诱导的细胞凋亡过程DR被FasL和TNF等结合后，单分子三聚体化，使死亡结构域结合到一起。这种结构的重组使其与细胞浆内相应受体结合，形成Fas相关的死亡结构域（Fas associated death domain，FADD）或TNF受体相关的死亡结构域（TNF receptorassociated death domain，TRADD）。然后结合于半胱氨酸天冬酶8前体（procaspase 8），通过溶蛋白性裂解作用转变成天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8（caspase 8）。
caspase 8是一种蛋白水解酶，FADD加上caspase 8被称为死亡诱导信号复合体（death inducing signaling complex，DISC）。caspase活化后催化一系列蛋白水解反应，促进凋亡的进程。研究表明，caspase在病毒性肝炎发病机制中起重要作用。Bantel等发现，caspase活性增高是HCV所致肝损害的特征之一，炎症坏死的程度与该酶的活性呈正相关。炎症程度Ⅰ（Grade Ⅰ）的患者有7.7%的肝细胞内存在caspase3激活，8.7%的肝细胞中存在有caspase7激活；而GradeⅢ的患者中上述比例分别为20.9%和19.5%。同时研究还发现，炎症程度与病毒载量与ALT水平无相关性，也提示生化学指标并不能完全反映疾病的严重程度。
当TNF-R1与TNF结合后，TNF-R1三聚体化形成TRADD。TRADD成为一个招募各种凋亡相关分子的场所，包括FADD、TNFR、RIP等。RIP和TRAF2的结合促进转录因子的激活，进而活化凋亡抑制基因。具体机制是RPI与TRAF2结合到DR使核因子蛋白激酶NFκβ（NIK）活化，反过来激活催化复合体Iκβ激酶（IKK complex），使NFκβ抑制蛋白磷酸化，即Iκβα。这一过程为NFκβ进入细胞核创造了条件，使目的基因得以转录，细胞得以存活。因此，抑制NFκβ使细胞对凋亡的敏感性增加。
3. HCV感染与凋亡
（1）TNF-TNFL途径：TNF-TNFL凋亡途径在HCV肝损害机制中起到一定的作用。理由如下：①HCV感染后肝内TNF产量增加，HCV特异性TCL细胞产生TNF也明显增多。②HCV感染者外周血TNF浓度增加。③TNF-R1在丙型肝炎患者体内表达增加。④急性HCV感染者外周血TNF浓度增加的同时也伴随着可浓性TNF受体1的增加，并且其浓度与ALT水平呈正相关。⑤在半乳糖胺/TNF或内毒素诱导的小鼠肝炎模型中发现，肝细胞坏死及转氨酶升高过后，凋亡相关的肝损害明显。HCV核心蛋白可结合于TNF-R1的胞内结构域，起到促进凋亡的作用。但TNF-R1途径本身十分复杂，一方面促进细胞凋亡，另一方面也诱发细胞生存信号。因此，HCV核心蛋白也可以通过TNF-R1来激活NFκβ。
(2)Fas-FasL（CD95-CD95L）途径：Fas-FasL被认为是最重要的一条途径。Fas或FasL基因突变小鼠的一个显著特征是肝的过度增生并伴随一系列的自身免疫现象。向小鼠体内注射抗Fas抗体或重组FasL后，小鼠很快发生肝衰竭而死亡，病理结果提示大面积肝细胞凋亡。而穿孔素和(或)Fas缺乏的小鼠则无法清除多种病毒的感染。因此Fas凋亡与HCV感染的结局密切相关。HCV感染后，肝细胞Fas表达上升、T淋巴细胞FasL表达增加，并且这种变化与炎症程度相关。进一步分析发现，受染肝细胞Fas明显高于未感染HCV的肝细胞，而且Fas表达的高低与肝细胞凋亡呈正相关。HCV感染者血液中Fas含量也明显高于健康对照者。推测FasL阳性的T淋巴细胞与Fas阳性的肝细胞相互作用是肝细胞凋亡的原因之一。
如前所述，感染初期T淋巴细胞反应是决定患者转归的重要因素。免疫系统清除病毒可以通过直接溶细胞作用来清除受染肝细胞，但目前的观点认为：清除病毒的主要途径并不是溶细胞作用，而是非溶细胞的病毒清除机制。IFNγ是非溶细胞清除病毒机制中关键的细胞因子。IFNγ也是细胞凋亡反应的重要调节因子。Th1类细胞因子TNF和IFNγ起到上调肝细胞Fas和淋巴细胞FasL的作用，FasL又可通过诱导IL-1β等细胞因子来发挥抗炎的作用。由此可见，HCV感染后机体免疫反应与肝细胞凋亡之间有着紧密的联系。
尽管HCV感染有致肝细胞凋亡的作用，但同时HCV蛋白又有抗凋亡以维持其持续感染的一面。例如，有研究表明HCV可维持线粒体功能以阻止Fas凋亡途径。另有研究表明HCV核心蛋白可通过诱导细胞持续表达c-FLIP（caspase 8的抑制物）而达到阻断凋亡的作用。
总之，HCV有促细胞凋亡和抑制凋亡的双重作用。两种作用均可以为丙型肝炎的治疗提供新思路和新方法。为了清除受HCV感染的肝细胞，可以采用促凋亡的方法。例如Hsu EC等通过强行使肝表达一种被修饰的Bid来诱导肝细胞凋亡，这种治疗可以选择性地通过使受染肝细胞凋亡而达到血清HCV含量下降的目的。相反，对于抗病毒治疗效果不理想的患者，减少肝细胞破坏、阻止肝纤维化进程则是治疗的主要目标。这时可采用抑制细胞凋亡的方法。事实上，一种pancaspase的抑制药目前正在抗病毒无应答的HCV感染者中进行临床试验。相信将来利用细胞凋亡能获得更有价值的治疗方法。
（闫涛）