第16章 丙型肝炎的疫苗研究 (2)
病毒样颗粒（VLP）极大程度地模拟了天然病毒体的特性，包括相似的形态、构象、理化特性和抗原特性，使VLP疫苗成为HCV疫苗研究热点之一。包含HCV结构基因的重组杆状病毒可在昆虫细胞内表达装配出直径20～50nm的HCV病毒样颗粒（HCV-LP），即不含HCV基因组、本身不复制而能较好地保留HCV抗原性的病毒样颗粒。HCV-LP能和不同基因型HCV感染的患者血清反应，提示其表面可能有一些在HCV株中普遍存在的保守表位。
HCV-LP能诱导很强的体液免疫应答，产生的抗C和E2蛋白抗体能与不同基因型HCV的对应蛋白反应，同时通过MHC-Ⅰ类途径，诱导产生了抗HCV的细胞免疫应答，包括特异性CTL应答和Th应答。但同时其体液、细胞免疫应答的程度受抗原剂量以及VLP颗粒构象的稳定性影响。也有研究则显示使用佐剂10105（含CpG基序的寡核苷酸）或AS01B（单磷酰脂类A与Q S21的复合物）均能增强HCV-LP的免疫原性。如果两者联合使用还可发挥协同作用，使HCV-LP的免疫效果更好。因此HCV-LP既能诱导很强的体液免疫又能产生较好的细胞免疫应答，再辅以新型佐剂有望发展为候选的HCV疫苗。但也有不少研究报道其免疫效果与蛋白疫苗相似，对于VLP疫苗能否携带多个CD+4与CD+8位点并克服不同的MHC类限制，能否产生广谱的、中和不同基因型与准种的抗体应答，仍不明确。
DNA疫苗是一种新型的免疫治疗方法，它由编码病原体抗原的基因及作为真核细胞表达载体的质粒DNA组成，接种后在体内利用宿主细胞的转录系统表达抗原蛋白，可诱导产生特异性体液及细胞免疫应答。其在体内可持续表达，稳定性好，变异可能性小，可构建多价疫苗，免疫效果好，维持时间长，具有潜在的优越性。
早期研究者多采用HCV全基因DNA疫苗，但全基因中一些不合理的表位可导致免疫耐受、免疫偏差、免疫缺陷等负面效应，导致许多天然抗原引发的免疫应答不能满足预防感染与预防发病的需要，治疗效果均不是很理想。而近来的研究主要集中在核心蛋白C区和包膜蛋白E区。在HCV基因组中，C区是最为保守的区域，所表达的C蛋白是T细胞的强免疫原。因此包含C区的HCV核酸疫苗可能诱导高水平特异性抗体应答及CTL活性，若加入含重要中和抗原表位的包膜蛋白，可提高抗原的免疫原性。因此，近来各国研究者均将目标投向构建C+E区的疫苗。实验表明。包含C＋E1＋E2区构建的基因疫苗，不仅能在哺乳动物体外细胞中表达C、E1、E2蛋白，还能诱导小鼠产生特异性CTL和抗C、抗E2抗体应答。既可产生高滴度的抗体反应，又可诱导明显的脾细胞对HCV抗原增殖反应和CTL杀伤活性。
DNA疫苗可同时诱导抗体反应和CTL反应，其中CTL反应居于主导地位，因此设计包含有多个保守HCV抗原表位及辅助性T细胞表位的多价融合抗原基因的治疗性DNA疫苗，可以在人群的不同个体中激起广泛而强烈的对不同HCV基因型和分离株有交叉反应性的T细胞免疫反应，并有望应用于HCV感染者的治疗及健康人群的预防性接种。多表位DNA疫苗（multi-epitope DNA vaccine，minigenes/epigenes）是指通过筛选与组合优势抗原表位（包括T细胞、B细胞表位）基因，以能产生高效细胞、体液免疫应答进而清除HCV病毒为目的的新型核酸疫苗。最常用的组合方式是优势B表位、Th表位和CTL表位基因串联连接，其特点在于筛选特定的B细胞与T细胞表位，构建于适当的载体中，再附以必需的侧翼序列或免疫调控序列，可诱生针对所选表位的特异性免疫应答。其优势在于通过选择最具免疫保护潜力的表位以覆盖尽量多的病毒亚型和诱导全面的机体抗病毒免疫应答，并尽量减少无关、干扰和抑制序列可能产生的负面影响。
DNA疫苗由于在体内表达病毒抗原，因而在诱导细胞免疫应答有优势，但目前的研究结果显示其所引起的特异性免疫反应并不十分理想。其主要问题在于编码基因的体内表达水平相对较低，甚至免疫接种的途径和方式不同，也可导致机体对DNA疫苗产生不同类型、不同强度的免疫应答。故此人们采用多种手段提高DNA疫苗的效率，包括：应用细胞因子与共刺激分子；应用脂质体、CpG、Flt3配体、阳离子多聚体等佐剂；采用自我复制的病毒复制子；优化疫苗接种途径等。
载体疫苗是将抗原基因通过无害的微生物载体进入体内诱导免疫应答，可持续表达大量的目的抗原，且病毒本身作为佐剂可有效地进行主动免疫治疗，从而激活天然免疫，进一步增强抗原特异的获得性免疫应答。各种表达HCV基因的减毒、缺陷病毒载体正在研究中，如腺病毒、AVIPOX、α病毒和痘苗病毒等。其中重组腺病毒、痘苗病毒载体应用较广。其优势在于已在人体应用多年，安全可靠，且可促进DC成熟，增强抗原提呈，给药途径多种方便等。但其也存在一定的问题。主要是人体内可能预先存在针对载体的免疫力，这样会大大削弱了疫苗的应用效果。个别载体可能引起严重的不良反应。
转基因植物疫苗是将编码基因导入可食用植物细胞的基因组中，免疫原即可在植物的可食用部分稳定地表达和积累。人类和动物通过摄食达到免疫接种的目的。例如黄瓜花叶病毒嵌合体（其表面有来源于多个的HCV-E2的HVR1序列合成肽）能在家兔体内激发特异性体液应答，在HCV感染者中能下调淋巴细胞CD3和CD8密度，增加IFN-γ、IL-12 p70和IL-15的释放，而其特异的CD+8T细胞也被检测到，可作为食用的疫苗开发。
考虑到上述各种研发疫苗所面临的各种问题，结合既往其他病毒疫苗的研究经验，有学者提出联合免疫方案（primeboost），即运用DNA疫苗初次免疫和重组痘病毒或腺病毒或蛋白疫苗加强的联合方案。多位学者采用不同DNA疫苗初次免疫（改变Th1与CD+8应答）与腺病毒载体疫苗加强的联合免疫方案，可在外周血及肝内产生HCV特异的CD+8T细胞应答，该应答呈多位点强交叉反应性。另有学者研究了DNA疫苗初次免疫—蛋白疫苗加强的联合免疫方案所产生的免疫应答及免疫保护效应，结果表明，疫苗能激发较强的体液与细胞免疫应答。因此，多个抗原的联合与多种疫苗（DNA/蛋白/重组痘病毒或腺病毒）的联合免疫方案（primeboost）是目前认为最有前景的研制策略。
HCV疫苗的发展尽管已有实质性的进步，但仍不尽如人意。到目前为止尚未发现有效的HCV广谱的中和抗体，以阻止HCV的感染及加速HCV的清除。旨在诱生强大持续的多个特异性Th1型偏向的细胞免疫应答（CD+4与CD+8），以清除体内HCV病毒及受HCV感染的细胞的HCV免疫原及免疫方案，也有待进一步研究。而这两点对于发展丙型肝炎疫苗，提高疫苗效能将是不变的选择。此外寻找和建立具有实用性的HCV动物模型，发展新型高效的免疫佐剂也是丙型肝炎疫苗研究需要高度关注的问题。相信随着免疫学理论与技术的发展、对HCV免疫保护机制的深入认识及体外感染动物模型的建立完善，在不久的将来，HCV疫苗的研究一定会取得突破性的进展。
（夏杰）