第16章 丙型肝炎的疫苗研究 (1)
丙型肝炎病毒（HCV）全世界感染率为0.1%~5%。HCV感染后，约70%转为慢性肝炎患者。除了15%的患者可自行恢复外，以PEG-IFNα和利巴韦林为主要的抗病毒治疗，其临床有效率不足50%。对于HCV病毒感染所致的终末期肝衰竭，肝移植是其惟一的治疗手段。但术后HCV的再感染仍旧无有效办法。因此研制一种预防性甚至治疗性疫苗来解决HCV感染所引起的健康问题，一直是研究热点。
HCV基因组为一线状单股正链RNA，全长9.4～9.6kb，由编码区、5′-非编码区和3′-非编码区组成。编码区包括结构基因和非结构（NS）基因。结构基因分C区和E区，相应的编码产物分别是核心蛋白和包膜蛋白。非结构基因分别为NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b基因。E区又分成E1区和E2区，后来认为NS1基因实际就是E2区，故用E2/NS1表示。C区和E1区、E2/NS1区表达产物（核心抗原和包膜蛋白）均含重要的抗原表位（核心抗原和包膜抗原）。目前世界各地分离的HCV RNA，以C区和NS3～5区最保守，E基因核苷酸同源性较低，特别是E2/NS1区变异性最大，称高度可变区（HVR）。HCV RNA在复制过程中，有很高的变异率，以形成相互关联而各不相同的准种为主，准种可以使病毒逃避宿主的免疫监视，引起感染持续化。在对一个准种的反应中产生的抗体对另一准种不能提供有效的保护，日积月累的变异又可使病毒基因序列发生明显的差别而形成不同的基因型和亚型，这就是HCV疫苗研制无突破性进展的主要原因。
由于HCV至少存在6种不同基因型，包膜糖蛋白（E1、E2）有很高的突变率，HCV体外复制能力差，缺乏较敏感的组织培养方法，理想的动物模型亦难寻找，这些因素使HCV疫苗研制面临巨大挑战。随着对HCV免疫清除机制的逐渐认识，诱导交叉反应性中和抗体和细胞免疫应答已成为丙型肝炎疫苗研究的基本方向。一个有效的HCV疫苗可能需要同时诱导高滴度的、长期存在的高交叉反应中和性抗体以及包含辅助T细胞和CTL细胞在内的广泛的、强烈的和多特异性的细胞免疫反应。正在探讨并进行临床前期评估的HCV疫苗形式包括：蛋白疫苗、合成肽疫苗、病毒样颗粒疫苗、DNA疫苗、载体疫苗以及转基因植物疫苗等。
体液免疫应答在保护机体免受病毒的攻击中发挥着重要作用。诱生机体产生中和抗体是发展病毒疫苗的重要策略，也是许多现有疫苗成功应用的基础。中和抗体在传染性疾病的预防中具有重要的作用，传统上以体液免疫的强弱评价疫苗是否有效。针对一种HCV产生的中和抗体不能预防其他型HCV的感染，使以刺激机体产生中和性抗体为目标的预防性疫苗的研制极为困难。
现在已经明确HCV包膜糖蛋白E2区，特别是位于E2氨基端的高变区1（hypervariable region1，HVR1）是诱导中和抗体产生的主要抗原区，在HVR1中存在数个线性中和抗体表位。然而HVR1在HCV感染过程中一直处于高度变异之中，已产生的HVR1抗体往往并不能中和新出现的变异株。由于HCV的这种准种特性，尽管有实验证明，无论在体内还是体外，HCV感染后均能产生中和抗体，但这些抗体具有严格的毒株特异性，对变异毒株缺乏有效的交叉中和保护作用。这对研究诱导中和抗体的丙型肝炎疫苗无疑是非常不利。同时，众多的研究表明HCV E2的中和表位仅能诱导低水平的抗体应答。无论是HCV自然感染，还是用E1/E2蛋白免疫，均难以诱导强而持久的中和抗体应答，这是HCV易慢性感染和再次感染以及包膜蛋白疫苗失保护的重要原因。
不过近来新的研究表明，尽管HVR1区高度变异，但其中部分位置的氨基酸残基仍具有一定的保守性。他们认为HVR1部分序列保守的情况下，即使该表位部分氨基酸序列被其他HCV毒株替代，仍可诱导产生具有广泛交叉反应性的抗体。即具有相似保守特征HVR1之间还存在明显的交叉抗原性。这为开发出具有广泛中和活性的HCV预防性疫苗展示了新的希望。单一多肽疫苗免疫原性较弱，可望通过构建多价多肽并结合佐剂得以改善。有研究采用噬菌体技术，用不同HCV阳性血清筛选出一系列具有不同交叉反应原性的HVR1模拟表位肽，合成复合抗原肽（multiple antigenic peptides，MAP）。用此MAP免疫动物，所得到的血清也具有高交叉反应性。采用具有高交叉反应性的抗原肽作为免疫原，可诱导产生具广泛交叉反应性的抗体，这为开发出具有广泛中和活性的HCV预防性疫苗展示了新的希望。
此外，以HCV外膜区为基础的疫苗面临的另一个难题是膜区蛋白质的来源问题，通过体外表达获得足量具有天然构象或与天然构象类似的蛋白是HCV疫苗新的来源。
细胞介导的免疫，尤其是特异性CTL活性，对细胞内感染病原体的清除起着举足轻重的作用。在病毒感染过程中，机体可产生活化的CD+8T细胞，识别与MHC分子相结合并表达于感染细胞表面的病毒抗原表位，在黏附分子的辅助作用下，杀伤感染病毒的靶细胞，清除病毒，同时也造成感染组织的损伤。从许多对急性HCV感染后恢复的患者研究中发现，其感染控制与细胞免疫相关。被感染的人和黑猩猩早期表达大量MHC-Ⅰ限制性HCV特异性CD+8细胞和MHC-Ⅱ限制性CD+4T细胞应答，能清除病毒。HCV感染的患者若能在感染的早期产生较强的针对HCV各个蛋白的多表位特异性CTL，则患者的感染多表现为自限性；而当患者特异性CTL的活性较低或仅针对个别表位时，则可导致HCV感染的持续状态，并可造成肝组织的慢性损伤。很明显针对多个CTL位点（epitopes）的广谱CTL反应有利于HCV的清除。
目前，在HCV保守性较高的核心蛋白和非结构蛋白中，均已经鉴定出了一系列CD+4与CD+8T淋巴细胞表位。一些表位不但序列比较保守，且能被不同MHC分子交叉提呈。此外，一些相关研究表明，针对多个表位、持续稳定的CD+4Th1细胞反应对于建立和维持HCV特异性CD+8CTL活性、防止病毒MHC-Ⅰ类表位的突变逃逸具有关键作用。对HCV患者的细胞因子谱进行分析后发现：能产生Th1相关细胞因子（IL-2，IFN-α）的患者更易清除HCV的感染，特别是非结构蛋白3特异性CD+4T细胞免疫反应（Th1型）对于病毒的清除似乎是必需的。因而组合不同的T细胞表位的合成多肽疫苗值得深入研究。
多肽疫苗除了可以诱导体液免疫应答，同时可以增强细胞介导的特异性免疫应答。其焦点在于发展能诱导强而有交叉反应能力的长效的细胞免疫应答疫苗。不同肽段的组合，包含了不同HCV抗原，并覆盖了不同的MHC分子。如果肽序列包括一个CD8和一个CD4表位，那么对肽发生免疫反应的特异性CTL诱导能够被最优化。然而细胞免疫有较大的异质性，其个体差异较大，不仅受MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类抗原等位基因的影响，还会受到非遗传因素的影响。此外HCV的T细胞表位的变异更增加了相关疫苗研究的难度。