第13章 病原学、免疫学及生化检测 (1)
第一节 病原学分离鉴定
一、细菌的培养及分离鉴定
（一）基本理论
微生物是存在于自然界中的一群体形细小、构造简单、肉眼直接看不见、必须借助光学显微镜或电子显微镜放大几百倍、几千倍甚至几万倍才能观察到的微小生物。微生物种类在数十万种以上，广泛分布于江河、湖泊、海洋、土壤、空气、矿层等，其中绝大多数对人类、动植物是有益的，而且是必需的，其在农业、工业、医药及石化领域的应用已获得了巨大的成功，并产生了巨大的经济效益。但微生物中有一小部分可以引起人类或动、植物的病害如人类的伤寒、痢疾、脊髓灰质炎，畜禽的炭疽、猪瘟、鸭瘟，植物的小麦赤霉病、大豆病毒病等。这些具有致病性的微生物称为病原微生物。
（二）基本知识
1.微生物分类 微生物虽然个体微小，但具有一定的形态结构和生理功能，按其结构和组成的差异，可分为3大类。
（1）非细胞型微生物：体积微小，能通过滤菌器，只能在活细胞内生长增殖，如病毒。
（2）原核细胞型微生物：仅有原始核，无核仁和核膜，缺乏完整的细胞器。这类微生物有细菌、衣原体、立克次体、支原体、螺旋体和放线菌。
（3）真核细胞型微生物：细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体，胞质内有完整的细胞器，如真菌。传统的细菌分类是按界、门、纲、目、科、属、种分类。种是细菌的基本分类单位，同一种细菌的形态、生理特性和组成成分都基本相同，具有密切相关的种组成属，例如痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺和宋内志贺菌等组成志贺菌属。有共同亲缘关系的志贺菌属、沙门菌属等组成肠道杆菌科。同一菌种之间仍有一定的差异，故种以下还可分型和变种，又根据抗原结构不同可分成不同血清型，对噬菌体或细菌素敏感性不同分成多种噬菌体型或细菌素型。变种是指某些特性与典型种比较有明显差异的细菌。株是指不同来源的相同的种（或型），具有典型特征的菌株称为标准株。
2.细菌的生长繁殖
细菌在适宜的条件下，从外界摄取营养，一方面进行分解代谢以获得能量，一方面进行合成代谢以合成菌体自身的成分，故细菌新陈代谢的结果可表现为细菌的生长繁殖。
（1）细菌生长繁殖所必需的条件
①充足的营养。细菌所需的营养物质有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子，首先必须保证有充足的营养来源，细菌才能生长繁殖。
②合适的酸碱度。大多数细菌最适酸碱度为中性或弱碱性，即pH7.2～7.6，个别细菌在较碱性的培养基中生长良好，如霍乱弧菌。
③适宜的温度。各类细菌对温度的要求各不相同，可分为嗜冷菌、嗜温菌、嗜热菌3大类。温度低到接近冰点，高到90℃都有细菌可以生长。病原菌在长期进化过程中已适应于人体环境，均为嗜温菌，在15～40℃范围内都能生长，但最适温度与人的体温相同，即37℃。
④必要的气体环境。与细菌生长有关的气体，主要是氧与二氧化碳。需氧菌利用分子氧作为最后受氢体以完成呼吸作用，故需供给氧气；而厌氧菌则必须在无氧环境中才能生长。一般细菌的新陈代谢过程中需要二氧化碳。
（2）细菌以简单的二分裂法行无性繁殖：在适宜条件下生长速度极快，分裂一次需时仅20～30分钟（少数细菌较慢如结核菌18～20小时才分裂一次），按此速度经10小时后，一个细菌将繁殖成10亿个菌，但由于营养物质之耗竭，毒性产物之积聚，事实上不可能始终保持这样的速度无限地增殖，经过一段时间以后，繁殖速度逐渐减慢，死亡菌数逐渐增加，活菌增长率随之而趋于停滞以至衰退。
（3）细菌群体的生长繁殖可分四期
①迟缓期。此期中细菌体积增大，代谢活跃但不分裂，菌数并不增多。此期长短不一，从数小时到数天不等，视菌种、菌龄与接种菌量和营养物质的不同而异。
②对数生长期或指数期。此期中细菌生长迅速，以恒定的速度进行分裂繁殖，菌数以几何级数增长，在生长曲线上菌数的对数呈直线上升，增长极快。此期细菌的形态、染色、生理活性等都比较典型，研究细菌的性状最好选用此期的细菌（再培养18～24小时）。
③稳定期。对数期后，细菌繁殖速度渐趋下降，细菌繁殖数与死亡数几近相等，活菌数不增不减，保持稳定。此期中，细菌可出现种种形态与生理的变异，开始积累贮存物质如糖原颗粒、异染颗粒等，细菌的代谢产物如外毒素、抗生素等多在此期产生。
④衰亡期。稳定期继续发展，细菌死亡数越来越多，活菌数急剧减少，随着细菌死后发生自溶，总菌数开始下降。此期细菌形态显著改变，出现畸形或衰退型等多形态，生理代谢活动也趋于停滞。
（三）基本技能
1.形态与染色
细菌个体很小，一般以微米作为测量其大小的单位，细菌的外形有球形、杆形、螺形3种基本形态，分别称为球菌、杆菌、螺形菌。大多数球菌直径约1μm、杆菌长2～3μm。
（1）不染色标本检查法：细菌不经染色直接镜检，一般主要用于检查细菌的动力及运动状况，常用的方法有悬滴法和压滴法，以普通光学显微镜观察，如用暗视野或相差显微镜观察则效果更好。
（2）染色标本检查法
①细菌标本经染色后，由于细菌与环境间在颜色上形成鲜明对比，所以在普通光学显微镜下即可清楚地看到细菌的形态和某些结构，并可根据染色反应及着色深浅对细菌加以分类鉴定，因此应用较广。
②目前常用的染料为人工合成染料，为含苯或苯环的衍生物，难溶于水，易溶于有机溶剂，通常被制成盐类。一般可分为4类：一是碱性染料，如结晶紫、亚甲蓝、碱性复红等。二是酸性染料，如伊红、刚果红、酸性复红等。三是复合染料（中性染料），如伊红亚甲蓝、伊红天青等。四是单纯染料，如苏丹类染料。
③细菌染色的操作步骤。涂片制备：随标本种类略有不同，可直接涂抹于洁净载玻片或经乳化以接种环扩成1cm2大小的涂面，放置于室温下自然干燥或用远火慢慢烘干。固定：一般用火焰加热法，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，目的是杀死细菌，凝固细胞质和其结构，改变对染料的通透性。媒染：目的是增加染料和被染物的亲和力，常用的有明矾、鞣酸、苦味酸、碘等。染色：随目的而选用染液，染色时滴加染液以覆盖涂面为度，时间随方法而定。脱色：可查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。复染：已经脱色处理或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成一鲜明对比，所以复染也称为对比染色。
④结果观察。细菌标本经染色后一般是直接置光学显微镜下进行观察。
⑤目前常用的染色法有单染法、复染色法、特殊染色法、负染色法和荧光染色体法等。
单染法：只用一种染液，可显示细菌的形态与排列，不能显示细菌的结构与染色反应的特性。
复染法：用两种以上不同颜色的染料进行染色，除可观察细菌的形态、排列、大小外，还能将细菌染成不同的颜色，反映出细菌的染色特性，具有鉴别细菌种类的实用价值，故又称鉴别染色法，常用的有革兰染色法和抗酸染色法。
⑥革兰染色法是最常用的鉴别染色法之一。标本经固定后，先用结晶紫染色、再加碘液媒染、然后用乙醇脱色，最后用沙黄或复红复染。革兰染色法具有以下重要的实际意义。
鉴别细菌：可迅速将所有细菌分为阳性和阴性2大类，以初步识别细菌，缩小范围，利于进一步鉴定。选择有效药物：革兰阳性菌和阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别，对抗生素的敏感性不同，临床可根据革兰染色性的不同，供临床选用有效药物。与致病性相关：大多数革兰阳性菌的致病物质多为外毒素，而阴性菌为内毒素。
（3）注意事项：染色液配制后，必须用适当的标准菌株作阳性及阴性对照，并在该批的使用期内每隔一段时间进行检测，用于监控的菌种有金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、普通变型杆菌、志贺菌等。
2.细菌的培养与分离
大多数细菌可以用人工方法培养，但必须根据不同的细菌采取各自适宜的条件，如无菌技术、接种和分离方法、培养基和培养条件等。
（1）样品处理：标本采集是否符合要求，直接影响细菌的检测结果，因此要求除粪、痰、咽拭子等标本，其他样本均应以无菌技术方法采集。采集时间宜于病程的急性期、早期、症状典型或用药前。采集量不得太少。标本盛于无菌容器内。根据目的菌的种类采用不同的方法采集。标本采集后及时冷藏送检。
（2）无菌技术：细菌学检验必须随时防止污染和病原菌的扩散，为达到此目的而采取的技术就是无菌技术或无菌操作，在进行细菌培养检查过程中，无论是标本采集或培养操作，均需严格执行无菌操作技术。
①所用器具、培养基等必须经严格灭菌，使用过程中不得与未经消毒物品接触，忌长时间暴露于空气中，有盖的应迅速盖上。
②进行细菌检验的全过程均应在无菌室、接种罩或生物安全柜内进行。
③灭菌的试管、玻瓶等在打开盖后及关闭前，口部应在火焰上通过1～2次，以杀灭可能从空气中落入的杂菌；接种环或接种针每次使用前后，均应在火焰上烧灼灭菌，金属棒或玻璃棒部分亦须转动通过火焰3次。
④检验时忌用手接触标本及已灭菌的器材内部，也勿用口吹以防其他杂菌混入培养物中。
⑤打开瓶塞及试管塞时，应将塞子上端夹持于手指间适当位置，不得将棉塞任意放置别处。
（3）接种、分离及结果观察：接种细菌应用接种环（针）来蘸取细菌标本，进行接种，其程序可分为：灭菌接种环→俟冷→蘸取细菌标本→进行接种→接种环灭菌5个程序。不同培养基接种方法不同。
①平板划线分离法。是细菌分离培养的常用技术，目的是将混有多种细菌的培养物或标本中不同的细菌使其分散生长，形成单个菌落或分离出单一菌株以获得纯种。分区划线法：适用于含菌量多的标本中细菌的分离，可分4～5个区，每划完一区接种环灭菌一次，每一区的划线均与上一区的划线交接1～2次，使菌量逐渐减少，以获得分散菌落。曲线划线法：适用于含菌量不太多的标本或培养物的细菌分离，其法是先将接种物在平板上1／5处轻轻涂抹，然后以曲线方式连续划线接种。平板划线分离可使细菌在平板培养基表面生长，经一定时间培养后，可形成单一的肉眼可见的细菌菌落。菌落的大小、形状（扁平状、隆起状、凹圆状、凸圆状、露滴状、针头状）、色泽、边缘（圆形、不整形、丝状形）、透明度、湿润度、溶血现象等特点则因细菌的种类和所用培养基不同而异，是识别细菌的重要依据之一。
②斜面接种法。主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种，也用于纯种的传代，方法为挑取单个菌落在培养基的斜面底部向上划一直线，然后从底部作曲折划线，直至斜面近顶端止。一般可观察表面、透明度、湿润度和色泽等特征。
③液体接种法。用于肉汤、胨水、糖发酵管等液体培养基的接种。由平板或培养管取菌，使细菌混合液扩散于培养基中。肉汤培养一般可观察发育程度（有无生长、微弱、中等、旺盛）、混浊度（混、中等、微混、透明）、有无沉淀（粉状、颗粒状、絮状）、有无菌膜（膜状、环状、皱状）及气味和色素等。
④穿刺接种法。此法适用于试管内固体或半固体培养基的接种，用于保存菌种或厌氧培养，适于观察动力。方法为将接种物用接种针直刺入培养基的中心直达近管底部，后沿穿刺线退出。
⑤平板倾注法。用于水、食品中菌落数的测定。
⑥涂布法。用于标本中菌数的测定，目前多用于纸片法药物敏感测定的细菌接种。
3.生化反应
各种细菌具有各自独特的酶系统，因而在代谢过程中所产生的分解和合成的代谢产物也不同，这些分解或合成代谢产物又各具不同的生化特点，利用生物化学的方法来检查这些代谢产物以鉴别细菌，称为细菌的生化反应，其种类和方法很多，但归纳起来主要有以下几类：糖类的代谢试验、蛋白质和氨基酸的代谢试验、有机酸盐和铵盐的利用试验、呼吸酶类试验及其他酶类试验。下面以糖类发酵试验来加以说明：不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。即使能发酵某些糖（醇），但其产物也不同，如有的产酸、产气，有的产酸、不产气。根据这些特点来鉴别细菌。