第13章 病原学、免疫学及生化检测 (8)
⑤溶血性链球菌。操作步骤：取样液5ml加到50ml葡萄糖肉汤中，充分混匀，置35℃±2℃培养24小时后，接种血平板，置35℃±2℃培养24小时，挑取典型菌落，涂片，革兰染色镜检。镜检为革兰阳性，呈链状排列的球菌。进行链激酶试验、杆菌肽敏感试验。结果报告：镜检为革兰阳性链状排列球菌，血平板上呈现溶血圈，链激酶和杆菌肽敏感试验阳性，报告被检样品中检出溶血性链球菌。
⑥真菌菌落总数。操作步骤：待上述生理盐水自然沉降后取上清液做菌落计数。接种5个平皿，每个平皿中加入1ml上清液，倾入冷却至45℃的沙氏琼脂培养基15～25ml混匀，凝固后置25℃±2℃培养7天，分别于3、5、7天观察，计算平板上的菌落数，如果发现蔓延生长，以前一次的菌落计数为准。结果报告：报告计算与方式参照本节第五部分介绍的一次性使用卫生用品产品类样品细菌菌落总数的结果报告。
⑦真菌定性检测。操作步骤：取样液5ml加到50ml沙氏液体培养基中，置25℃±2℃培养7天，逐日观察有无真菌生长。结果报告：培养管混浊应转种沙氏琼脂培养基。证实有真菌生长，可报告被检样品中检出真菌。
3.一次性使用卫生用品生产场所类样品
（1）生产环境空气样品细菌菌落总数
①操作步骤。在采样前将准备好的营养琼脂培养基置35℃±2℃培养24小时，取出检查有无污染，将污染培养基剔除。将已采集的培养基在6小时内送实验室，于35℃±2℃培养48小时观察结果，计数平板上的细菌菌落总数。
②结果报告。报告计算与方式参照本节第五部分介绍的医院消毒监测环境空气细菌菌落总数的结果报告。
（2）生产环境工作台表面与工人手样品细菌菌落总数
①操作步骤。工作台：用一浸有灭菌生理盐水的棉拭子在工作台表面25cm2内涂抹10次，采完后放入装有10ml灭菌生理盐水的试管中。工人手：用一浸有灭菌生理盐水的棉拭子在右手指屈面，从指尖到指端来回涂擦10次，放入装有10ml灭菌生理盐水的试管中。上述样品充分混匀后，用灭菌吸管吸1ml，注入灭菌平皿中，将融化并冷至45℃的营养琼脂注入平皿内。每个样品平行接种两块平皿，待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±2℃培养48小时观察结果。
②结果报告。工作台表面，（cfu／cm2）=（平皿上平均细菌菌落总数×10）／采样面积（cm2）；
工人手表面细菌菌落总数，（cfu／只手）=平皿上平均细菌菌落总数×10。
（3）生产环境工作台表面与工人手样品致病菌检测按一次性使用卫生用品产品类样品致病菌检测过程操作。
4.质量控制
（1）主要仪器
①恒温培养箱，每天观察记录温度情况，每年由计量部门检定1次。
②高压灭菌器，记录好使用记录，每周1次灭菌效果监测，每年由计量部门检定1次。
③干热灭菌箱，记录好使用记录，每年由计量部门检定1次。
④恒温水浴锅，每天观察记录温度情况，每年由计量部门检定1次。
（2）耗材
①主要耗材。营养琼脂、液体硫乙醇酸盐培养基、真菌培养基、伊红亚甲蓝琼脂、乳糖胆盐培养液、十六烷三甲基溴化铵培养基、SCDLP培养基、葡萄糖肉汤、血琼脂、沙氏琼脂培养基、液体沙氏培养基等。
②耗材质量控制。购进的每批培养基在使用前进行培养基质量鉴定，鉴定合格后使用，鉴定方法见第六部分培养基质量控制方法。
③无菌检查所需标准菌株。藤黄八叠球菌（28001）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌（26003）。
（3）实验室内部质量控制
①所检项目内控。细菌菌落总数、真菌菌落总数每批样品采用稀释液空白和培养基空白对照；粪大肠菌群每批样品采用所需培养基做空白对照；无菌检查所用培养基使用前证明无菌方可使用以及使用前进行培养基质量检查，检测样品时采用阴性对照、阳性对照。
②环境内控。对净化室每天进行实时监测，每周进行1次空气消毒监测，每半年进行1次紫外灯效果监测，每年进行1次尘埃粒子监测。
六、培养基质量控制方法
（一）基本理论
为确保细菌检验工作质量，对细菌检验所用的各类培养基，都必须进行质量控制检验，选合格者使用。本质量控制方法分理化和细菌学2个方面。
（二）基本知识
1.理化项目及质量要求
（1）水分：控制6％以下。（原装无凝块，保持疏松粉末状）
（2）pH：应符合各种培养基本身的pH范围。
（3）澄清度：目测应符合常规要求。
（4）凝固度（凝胶强度）：手感适宜，划线时平板不破。
2.培养基的细菌学质控方法
（1）灵敏度：适用于营养琼脂和无菌试验用培养基的质控，此类培养基的种类很多，如营养琼脂、蛋白胨水、硫乙醇酸盐培养基、胰酪胨大豆汤培养基等，以及所有用于无菌试验的其他培养基均属此类。这类培养基一般均用于细菌的增殖培养，其质量要求除了理化性状外，对各类细菌的生长灵敏度是一个重要的质控指标。所以此类培养基均需进行灵敏度试验，经测试合格后方可使用。
（2）增菌倍数：适用于选择性培养基。此类培养基中一般均含有某种抑菌剂（抑制非目标菌生长）和丰富的营养物质（刺激目标菌增殖），因此此类培养基质控时，应选择适当的目标菌和适当的非目标菌分别接种在此类培养基上，目标菌即使少量接种，在一定时间内也可达到增菌目的，而其他非目标菌则被抑制。
（3）菌落特征：适用于分离培养基的质控。此类培养基中，一般都含有某种指示剂和抑菌剂，以指示某种生化反应和抑制某些非目标菌的生长。所以在检定分离培养基质量时，应看其培养目标菌是否能很好地生长：同时根据与之伴随的生化反应的差别，又能抑制其他非目标菌生长。
（4）生化特性：用于生化特性试验的培养基称鉴别培养基，其基本反应原理是借助于某些微生物所特有的某种酶，对培养基中某一特有成分进行分解，如脱氢、脱氨、脱羧、发酵、水解等作用。在这些作用过程中往往会显示一定的生化反应，人们可以根据这些特有的生化反应情况，来判别某一或某些细菌是否存在，或分离所得的菌种属哪一类型。所以这类培养基配制（或购进）后，必须先用已知菌种进行鉴定，在证明能够显示其应有反应后方可使用。
（三）基本技能
1.灵敏度试验方法