第13章 病原学、免疫学及生化检测 (9)
（1）质控菌株：乙型溶血性链球菌NICPBP32210；革兰阳性杆菌NICPBP7316；破伤风梭状芽孢杆菌NICPBP64067（检定硫乙醇酸盐培养基或其他厌氧菌培养基时需用）。
（2）传菌：菌种新启后，在适宜的斜面上传二代后使用。NICPBP32210株在血斜面上置37℃，培养24～48小时；7316株在肉汤琼脂斜面上置37℃，培养18～24小时。NICPBP64067株在庖肉培养基中置37℃，培养24～48小时传二代后，取6mlNICPBP 64067庖肉培养物，分别加在2支离心管中（各3ml）平衡后，2000转／分钟，10分钟，离心后，倾去上清液后往沉淀管中加入2ml无菌生理盐水，2管混合后制成菌悬液，并取1ml菌液加到标准比浊管中，用5％的甲醛溶液稀释到与标准比浊管同样浊度，记录甲醛溶液的用量。另取1ml菌液加入与甲醛相同用量的无菌生理盐水，混合后进行10倍系列稀释到10-8。
（3）操作：挑取适宜的质控菌菌苔，在3ml无菌生理盐水中制成菌悬液。取1ml菌液于标准比浊管中，用5％的甲醛溶液稀释至与标准比浊管相同浊度，记下所加入的甲醛溶液的用量。然后在另一空试管加入1ml菌液，再加入无菌生理盐水，其加量与比浊时所加的5％甲醛溶液的用量相同，摇匀后做10倍系列稀释。NICPBP32210株稀释到10-9，NICPBP7316株稀释到10－8，NICPBP64067株稀释到10－8。最后NICPBP32210株取10－5～10－9，5个稀释度；NICPBP7316株取10－4～10－8，5个稀释度；NICPBP64067株取10－4～10－8，5个稀释度。
每个稀释度接种3管待试培养基，每管接种1ml稀释菌液，同时以不接种的同批培养基作空白对照（最好再用合格的同种培养基作标准对照）。接种完毕后置37℃培养3天，每天观察结果并做好记录。
（4）判断：连续3天观察结果，以接种管2／3生长的最高稀释度为该次试验所得的培养灵敏度。重复3次试验后，以2次达到的最高灵敏度为该批培养基的灵敏度。无菌试验用培养基的质控指标为：
①乙型溶血性链球菌NICPBP32210株达到10－8生长。
②革兰阳性杆菌 NICPBP7316株达到10－7生长。
③如检测硫乙醇酸盐培养基的灵敏度，需要增加破伤风梭状芽孢杆菌NICPBP64067（厌氧菌）为质控菌株。
④破伤风梭状芽胞杆菌NICPBP64067株达到10－7生长。所有质控菌株应全部达到质控指标才能判为合格。
2.增菌倍数质控方法（现以******盐胱氨酸增菌液为例简述其质控方法）
（1）质控菌株：目标菌，伤寒沙门菌NICPBP50098；甲型副伤寒沙门菌NICPBP50093；鸡雏沙门菌NICPBP50047；非目标菌，粪链球菌NICPBP32221。
（2）操作：质控菌株经37℃，24小时琼脂斜面培养复苏后，传于肉汤培养基中，经37℃，24小时培养后供使用。将肉汤培养物10倍系列稀释至10－6。取1ml稀释菌液接种于9ml******盐胱氨酸增菌液，重复接种3管，同时从同一10－5管稀释液中吸取0.1ml，涂抹于营养琼脂平板作菌落计数，重复涂抹3副平板。将上述增菌液和平板接种后置37℃，18小时培养后，平板作菌落计数。沙门菌的增菌液3管各取1ml混匀后，10倍系列稀释到10－5，取0.1ml涂抹于营养琼脂平板，重复3副平板，并于37℃，18小时培养后，作菌落计数。粪链球菌的增菌液3管混匀后，稀释到10－2，取0.1ml涂抹于营养琼脂平板重复3副平板，并于37℃，18小时培养后，作菌落计数。
（3）判断
①沙门菌增菌倍数=（增菌后平板菌落计数平均值×105）／增菌前平板菌落计数平均值≥105
②粪链球菌增菌倍数=（增菌后平板菌落计数平均值×102）／增菌前平板菌落计数平均值≤102
③合格指标。沙门菌增菌数应达105倍以上。粪链球菌的增菌数应低于102倍。
3.菌落特征质控方法（现以SS琼脂为例简述其质控方法）
（1）质控菌株：目标菌，鼠伤寒沙门氏菌NICPBP50013；甲型副伤寒杆菌NICPBP50093；痢疾杆菌NICPBP51335；宋内志贺菌NICPBP51592。非目标菌，大肠杆菌NICPBP44156；金黄色葡萄球菌NICPBP26003。
（2）传菌：新菌种开启后在斜面经37℃，培养18～24小时复苏后，传入肉汤培养基，再经37℃培养18小时后供使用。
（3）操作：目标菌与非目标菌大肠杆菌NICPBP44156按下列方式混合，无菌生理盐水9.7ml，非目标菌肉汤培养物0.2ml，目标菌肉汤培养物0.1ml。非目标菌金黄色葡萄球菌稀释50倍，肉汤培养物0.2ml，无菌生理盐水9.8ml。将各质控菌株的混合液摇匀后，分别取1环4区划线分离于SS培养基平板上，各组平板重复划线分离2～3副。经37℃，18～24小时培养后观察结果，必要时培养36～48小时再看结果。
（4）判断：正常结果。大肠杆菌生长应受到一定程度的抑制，少量桃红色菌落，沙门菌、志贺菌应为无色半透明菌落，NICPBP50013株在培养24小时后应显示黑色中心。金黄色葡萄球菌应不生长或微弱生长。
4.生化特性质控方法（现以赖氨酸脱羧酶培养基为例，简述其质控方法）
（1）质控菌株：鼠伤寒沙门菌NICPBP50013；普通变形杆菌NICPBP49001。
（2）传菌：经琼脂斜面37℃，培养18～24小时复苏二代后，供使用。待检培养基：赖氨酸脱羧酶培养基。对照培养基：脱羧酶试验对照培养基（培养基中不加氨基酸）。
（3）操作：挑取斜面菌苔同时接种于待检培养基和对照培养基，每组重复接种2～3管，加5～10滴无菌液状石蜡覆盖，并于37℃培养3天观察颜色变化。
（4）判断：脱羧酶阳性反应时培养基颜色为紫色。脱羧酶阴性反应时培养基为黄色。
（5）说明：本试验必须在培养18～24小时才能判断结果。一般以3～4天为最终结果的判定时间。如变色不清楚，可再加几滴溴甲酚紫指示剂后进行判定。出现任何紫色痕迹均应判为阳性。
培养基表面的蛋白胨，可因氧化和脱氨作用而产生碱性，造成假阳性反应，但在厌氧条件下，蛋白胨不能脱氨，故培养基表面必须严密覆盖一层液状石蜡，造成厌氧环境以防止这种假阳性的出现。
（倪雨中 柳丽江 钱惠芬 施菊萍）