王氏兄弟权势日渐增大，大有功高盖主之势，正因为此，晋元帝和王氏之间渐渐产生了矛盾。最初，王导被封为宰相后，王敦被任命为统帅，督军六州，兼“江州刺史”，镇守武昌。王敦就完全掌握了长江上游地区，声威极盛。
王敦长期统兵在外，“手控强兵，群从贵显，威权莫二，遂欲专制朝廷，有问鼎之心”，他本身就是一个狂傲有野心的人，现在拥兵自重，就越发不把晋元帝放在眼里。晋元帝为了防止王敦兵变，重用刘隗、刁协等人，逐渐削夺王氏的部分兵权，同时也对王导日渐疏远。中书郎孔愉说王导为人忠贤，有辅佐之功，应该继续重用，可是晋元帝非但不听，还将孔愉贬为司徒左长史。
王导对自己的升迁，倒是淡然对之，宠辱不惊，因此更深受群臣敬重。但王敦却对此愤愤不平，上疏朝廷，替王导鸣冤叫屈，言语之间，多见埋怨。恰好王导先看到了奏折，就封好退回王敦处。可王敦并不死心，第二次上奏，终于被晋元帝看到。晋元帝连夜把皇叔谯王司马丞召来，让他看王敦的奏章，问道：“王敦身为权臣，声望显赫，如今他还是不满足，言语傲慢，眼里根本没有我这个皇帝。现在应该怎么办？”司马丞的回答干脆利落：“陛下趁早杀掉他，以免出乱。”
在刘隗的建议下，晋元帝派司马丞为湘江刺史，坐镇长沙；以戴渊为征西将军、都督司兖豫并冀雍诸州军事、司州刺史，坐镇合肥；以刘隗为镇北将军、青州刺史，坐镇淮阴。以此三路兵马对驻兵武昌的王敦形成钳制之势。而此时，王敦也在调兵遣将，扩充军力，准备随时发动战争。双方的对立已经到了白热化程度，眼看一场战乱在所难免。
永昌元年（322）一月，王敦以诛刘隗为名起兵武昌。晋元帝安排的几路人马，都不能阻挡来势汹汹的王敦。当王导听说王敦起兵造反之后，心中慌乱不已，当即率领堂弟中领军王邃、左卫将军王虞、侍中王侃、王彬及宗族子侄二十余人，每天清晨入朝待罪。王敦之军势如破竹，很快向京城建康直逼而来。于是，晋元帝急调戴渊、刘隗回师驻守建康。
刘隗、刁协等人返京后，借机大进谗言，劝晋元帝将朝中的王氏族人统统杀死，晋元帝没有答应。但晋元帝此时却有杀王导之心，想以此来告诫王敦。周闻听后，急忙入宫求见晋元帝，上表劝谏晋元帝不要妄开杀戒和滥杀无辜。他在奏折中说道：王导与王敦不同，王导向来忠心事主，并没有参与到这次叛乱中来，此其一；如果杀掉王导，只会让王敦仇恨更深，若他拼死一战，京城建康可能难以保全。如今之计，倒不妨放过王导，让他去劝说王敦退兵；另外，罢免刘隗，将其逐出朝廷，以平息叛乱。
晋元帝采纳了周的意见，和王敦讲和，并下诏让王导官复原职，赦免王氏全族的罪过；随后，晋元帝召见王敦，加封他为前锋大都督。王敦虽然没有攻陷京城，但也算是出尽了风头，且又得到了封赏，于是就此罢休。
王敦和晋元帝讲和后，在朝中不可一世，并自己做主，杀掉了一大批和自己往日不和的大臣，并为自己的亲信争取了许多官职、封赏。当王敦和王导说到周时，王敦先是询问王导：“周名震大江南北，应当官任公卿？”王导沉默不语。王敦又问：“那让他担任普通的官职？”王导还是不说话。王敦最后问道：“不然就把他杀掉吧？”王导依旧一言不发。王敦于是下令手下将周诛杀了。
周死后没几天，王导整理大臣前段时间的奏折时，突然看到了周替自己向元帝求情的奏折。王导读罢，不由得惊呆了，随即双手握着走着，失声恸哭，追悔莫及：“吾虽不杀伯仁（周字伯仁），伯仁由我而死。幽冥之中，负此良友。”
王敦谋反虽没有最终成功，但现在坐拥重兵，对朝政指手画脚，恣意妄为，“四方贡献多入己府，将相岳牧悉出其门”，倒也十分逍遥。但是晋元帝司马睿却因为这件事情受了惊吓，患上了疾病，没过多久，就离开了人世。