抗日战争爆发之前，梅贻琦已把清华管理得越来越好。抗战爆发后，不少北方的名校迫于无奈南迁联合办学，由清华、北大、南开三所大学临时组合而成的西南联大就此应运而生，然而联合办学又谈何容易？
1937年夏天，清华正值暑假，然而校园内仍旧有200多师生留校。7月7日，这些留校师生听到了轰隆隆的炮声，不久，北平沦陷，老师学生开始流亡。早在“一二·九”运动之后，清华大学是对战局有着清醒认识的学校之一。当时梅贻琦跟教授开会共同讨论如何应对。在会议上，梅贻琦果断地决定停建了几个大的建设项目，提出了把省下来的建设款转而投入湖南，所以后来战争爆发以后，清华才有钱搬迁到长沙。在长沙，清华大学、北京大学、南开大学三校联合组成了长沙临时大学。在大灾难来临的时候，三个学校的师生齐心协力，艰难地度过了一个学期。然而，时局又发生了变化，南京沦陷，武昌告急，这所联合大学只好迁往昆明。
1938年的2月，梅贻琦曾经在日记中写道：“二十七年二月，临时大学又能奉命迁于云南省会之昆明，四月底全部到达，改名为西南联合大学……”而当时自从西南联合大学建成以来，学校的最高行政领导一直是由北大校长蒋梦麟、南开校长张伯苓和清华校长梅贻琦共同担任，但是由于张伯苓和蒋梦麟两人多参加政府要事，经常出差重庆。因此，西南联大校务工作实际上落到了梅贻琦一人的肩上。于是，梅贻琦实际上既是清华校长，又是联大的校长。
西南联大是由三所大学联合在一起的。而管理西南联大的困难不止在于当时的国难，还在于学校的联合。作为南开的第一批学生，张伯苓也曾经是梅贻琦的老师，梅贻琦与南开大学有着亲密的关系。当时北大的校长蒋梦麟无论在社会地位还是政治地位上都在梅贻琦之上，虽然蒋校长对联大的事务抱着“不管即是管”的超脱的态度，但要想维系大局，也不是一件简单的事。
对比三个大学的师资、学生、资金和学科设备，清华位居首位，其次是北大，南开最弱。因此当时就有一些清华的学生认为：“从世俗的眼光来看，这次联合对清华是不利的。”而北大的一些自恃“最高学府”的学生和教授也很难接受边缘化的联大，甚至在建校的一开始就有北大师生发出“独立”的口号。
1940年，日军大举侵入越南，昆明陷入危机，政府下令西南联大迁移到四川。就在去与留的争执中，“分校”的呼声也越来越强烈。实际上，北大要求“独立”并非由于传统的“自尊”，而是基于很多实际的利益，比如经费等问题。面对种种矛盾。1941年3月，梅贻琦在清华校务会议后决定“让售北大三千元美金”，并且在会议上规定了两个原则：第一，如果北大坚持分校，预算就按照三校分配，清华将对北大负全部的责任。第二，如果清华向西南联大拨出80万应急费用，那么西南联大多出的80万将作为补助给各校人员的费用，清华也应该按照比例得到相同的费用。很快，教育部经过研究提出了折中的方案：由清华借款五十万补助联大，用作研究的费用，三校按照比例分配支用。梅贻琦代表的清华接受了这个方案。至此，西南联大上空的乌云终于开始渐渐散开，三校联合体制步入稳定。
梅贻琦在西南联大团结了很多专家学者，让联大在物质生活很困难的情况下仍然能够烽火相传，这一时期，也造就了不少杰出的人才。据统计，在1948年的全国中央研究院院士一共有61人，而西南联大拥有院士头授的教师就有27人之多。
八年抗战中，西南联大能够团结发展，梅贻琦可谓功不可没。提倡民主作风的梅贻琦喜欢说“吾从众”。在处理很多具体的问题时，梅贻琦非常注重调节三校的关系，比如解决老师的生活困难问题。工学院的清华老师组织了“清华服务社”，开展生产和勘察等业务，并且把赚来的收益补助给清华、北大、南开的困难师生。很多西南联大的老师在回忆那段艰难岁月时，都对三校的合作精神大为赞美。郑天挺先生曾说：“西南联大的八年时间里，最值得珍贵的就是师生之间团结、友爱的感情。不止是老师和老师之间，学生和学生之间，学校和学校之间也都是如此。”
梅贻琦认为老师的职责不止在于教导学生读书，教学生如何做学问，还在于教学生如何做人。在这种思想的指引之下，西南联大也诞生了很多令人称道的学者。在抗战的艰难时期，社会动荡不安，但是梅贻琦和西南联大的师生们仍然坚持不懈，在危难时刻表现出中国知识分子的气节和爱国之情。
值得一提的是，梅贻琦爱学生、保护学生是他身上最显著的“标签”之一。傅任敢先生在文章《值得我们学习》中曾这样评价梅贻琦：“做领袖的通常是两种人，一种能够让人慑服，一种让人悦服。梅校长毫无疑问是第二种。作为教育工作者，理应让人悦服，因为教育的出发点就是爱。梅校长的品性中就具有这一点，他爱国家，爱清华，爱学校，爱他的学生，因此他把他的一生都奉献给了学校。他曾经把他的儿子亲自送到战场，他也曾用自己的全部力量去保护自己的学生……”
1935年，日本侵略者占领了东北、华北，整个中国陷入一片恐慌中。当时，清华的爱国学生发出呼吁：华北已经无法再安置一张平静的课桌了！清华学生开始自发组织各种抗日爱国运动，结果却遭到了军警的镇压。一次，军警到清华校园抓学生，学生们同警察发生了激烈的冲突，在场的老师们没有任何主意，于是，有人把目光投向了梅贻琦校长，意思是问：“我们该怎么办？”平时很少说话的梅贻琦仍然没有说话，直到国民党向梅贻琦索要学生的名单，想要按照名单抓人时，梅贻琦终于开口说：“你要名单，好，我这里有一份。”学生和老师都不理解梅贻琦的行为，不相信校长会出卖自己的学生。等到军警开始按照名单抓人时，大家才发现，军警一个学生也没有抓走。这是怎么回事呢？原来，梅贻琦只是把前一年的学生名单交给了军警。
实际上，梅贻琦非常理解，也非常同情学生们的爱国感情，他碍于校长的身份不能参与，但是他一直在尽力保护着他的校园和学生。学生游行回来后，梅贻琦总是派人开车把学生接回来，对于当局逮捕、开除学生，他也总是想法设法地加以保护，或者通知可能要被逮捕的学生立即离开学校。一次，为了保护一个学生脱险，他甚至把那名学生藏在自己的汽车里，想要偷运出去。而同学们也非常理解和体谅梅校长的苦心。每次发生学生运动，学生们害怕影响到梅校长，总是会先贴出拥护梅校长的大幅标语。
1945年，日本无条件投降，梅贻琦在西南联大的使命也顺利地完成，随后三所学校师生先后北上返校，而清华更是在梅贻琦的带领下第一个开学，并很快走上了正轨，迅速进入新的发展阶段中。
可以说，抗战烽火中的西南联大之所以能够傲然伫立，就是内部和外部共同努力的结果，外部取决于民主治校、学术自由等教育政策，而内在条件就是校长、老师、学生的全体努力。这一切都和梅贻琦不可分割。在战火频频，半壁沦陷的艰难环境中，梅贻琦保存了中国教育的元气，用自己的精神力量鼓舞和带动着学生们不断前行，在中国现代史上最为艰难的风雨岁月中，西南联大仍然能够取得傲人的成就——这是中国现代教育历史上的奇迹。