吴敬恒的曾祖父叫吴玉裕，祖父叫吴治永，父亲吴有成，世居雪堰桥。他的母亲邹氏是无锡北门人。他了生在农历二底，古书上将农历月底月亮出现在西方称为“朓”，故取名吴朓。
吴家历代以种田为生，家境贫困。吴敬恒的祖父死时，只能买口有缝的松木板然后用纸把缝煳起来。他的父亲吴有成，娶无锡北门的望族邹氏为妻，生一子三女，到吴敬恒这一代，吴家已接连单传五代，他的降生给吴家带来了极大的喜悦，也寄托了吴有成夫妇的殷殷厚望，他们悉心照料着他。
然而，不幸却相继降临吴家。他5岁那年，其母邹夫人病故。下葬时，只能在下层衬以稻草。接着，他的二妹、三妹相继夭折。他和大妹只好随外祖母陈太夫人到无锡外婆家生活，一直到他长大。他靠着自己的勤奋努力，成了民国的一位显赫人物之后，有人因他从少年到成人生活在无锡便称他为无锡人，尤其无锡因有了他而自豪。由于吴敬恒一口无锡话，至老未改，许多人把他当作是无锡人。吴敬恒对此常笑着回答：“谓余武进人可，无锡人可，总之中国人也。”
吴敬恒在民国历史上是位很独特而富于个性的人物，他的经历、阅历、学识和纯朴、正直的家风造就了他的个性风格，结识他的人都被他的才华横溢所吸引。
他在中举人之后，却接连三次会试均告失败；他仰慕新学、新文化、新知识，却因一位知县路过孔庙而不下轿，便毅然上前质问，被恼羞成怒的知县拘捕下狱；他教授私塾谋生，对主人家每天每餐的豆芽菜深恶痛绝，他在苦闷的生活中却由豆芽菜引发灵感，创制了一套拼音文字，称为豆芽字，从而开创了中国汉字拼音字母的先河；他以维新、革命自居。好友钮永建邀访孙中山他拒绝了，因他主张维新，不赞成革命。后来孙中山慕名拜访他，两人成了知己，誓同生死；他拥护民国革命，亲自设计制定了青天白日旗为民国国旗，但大总统孙中山留他在民国任职，授予他教育总长之职，他坚辞不就，并大力倡导革命党人不作家等八不运动等等。不过，当年令他名噪京师的，是他对末代皇帝溥仪的笑骂《冤哉溥仪先生，危哉溥仪先生》一文，此文把溥仪和他身边的龌龊小人们鄙薄、笑骂得淋漓尽致。
吴敬恒是位儒雅的书生，有着很浓的书卷味。他7岁时入私塾，天资聪颖，学习刻苦，师从于儒雅的启蒙老师张鼎臣。到18岁时，便开始以所学谋生，在无锡城内设馆教授生徒。他广泛接受新学、新文化，涉猎新知识，受徒之余常流连于春源社，与同道品茗、聊天、谈论八股文、交流新知识。5年后，他考中了秀才，回无锡后娶袁蕴生为妻，时年23岁。两年后，他以正取第一名考入江阴南菁书院——他从这时开始，改名吴朓，字稚晖。据说，他是在20岁之前，因偶得《谢宣城（朓）集》精本，极好其诗人，仰慕这位南齐的词采华丽、人称“小谢”的才子谢朓（字玄晖），所以才改名字。
1891年，吴敬恒27岁，应乡试，喜中举人。不幸的是，与他相依为命多年的外祖母陈太夫人这时去世，他悲痛万分，想多年来的养育大恩未报却遭此大故，不禁抚棺放声大哭。
第二年，入京会试，初试失利。他依旧回南菁书院教读，受到史学大师黄以周的器重——黄以周的座右铭是“实事求是，莫作调人”，他对黄以周十分敬仰，也视此铭为自己做人的座右铭。就在这一年，吴敬恒以非圣无法拦知县的坐舆，被衙役拘捕，关入狱中。黄以周极力营救，闹得满城风雨。知县最后承认拘捕举子为非法，郑重以轿舆伴着音乐送他回书院以谢罪。黄以周对他这一“惹祸”事件很是不满，坚决地将他逐出书院。此后接连两次参加会试，均告失败。
中日甲午战争爆发，中国战败，迫签丧权辱国的《马关条约》，康有为、梁启超等维新派领导了波及全国的维新变法运动。吴敬恒一则受到甲午战败的刺激，一则受到维新思想的影响，始觉中国要学习西方工艺造大炮机关枪才能抵抗敌人，所谓“兴学之不容缓”，乃开始冒充为维新派小卒。后来，他到天津北洋学堂教书。1897年冬放年假，他就去北京南海会馆拜访了康有为，大家谈到最重要的问题乃八股、小脚、鸦片三害，吴敬恒认为除此三害，要从自己做起，他说：“八股，我们可以自动不赴考；小脚，可以不缠；鸦片，可以相戒不染。”他还写了一个三千字的摺子，在1898年膛历春节那天地候在彰仪门大街，拦住了朝贺回宅的瞿鸿，请他专呈光绪皇帝，但瞿鸿说：“你的摺子还有可以商量的地方，我带回去细看再说”，然后轿即如飞而去。过了一天，吴敬恒知道不会有什么回音，便离京返津。
31岁时，吴敬恒在吴县陈容民家任教席，月束修10元。陈家每天每餐给他的伙食中都有一盘豆芽菜，他非常厌恶，痛苦不堪。无意间，看着豆芽菜，他触发了灵感，在无聊的日月中创制了一套文字，按《康熙字典》的韵创拼音字母，称为豆芽字。他用这套字教授其家人、亲友，并拼方言，很有成效。这套字开了中国拼音字母的先河。
1897年，吴敬恒32岁，任职天津北洋大学汉文教席。他与维新人物严复此时交往密切，常在一起谈论维新革命，并以维新派自居。他在北京南海会馆，第一次会晤了维新首领康有为。他北洋大学的得意学生王宠惠、王正廷，后来均成为民国历史舞台上的知名人物。因与北洋大学总办王苑生相冲突，毅然南下上海，就职于南洋公学任国文教习，改名为吴敬恒。在这里，他工作了三年，随即赴日本留学。
1898年6月，吴敬恒到上海南洋公学任教，这时，光绪帝颁布变法诏令，他闻讯后就在无锡崇安寺创办三等学堂响就变法，推行新教育，并与朋友约定不再读线装书，又改名敬恒以自警，即唯“敬”与“恒”方可肩天下之重任。
如果说甲午惨败使吴敬恒开始觉悟到中国不能不学西方式艺，那么戊戌变法的失败和八国联军侵华，进一步刺激他去寻找救国救民的真理。
1901年3月，吴敬恒离开财洋公学，东渡日本，进入东京高等师范学校读书。
不久，国内清政府开始实施“新政”，其中重要的一项内容就是办新学堂。他便于这年12月份从东京回到广东。吴敬恒在广东办学招生，直接接触到官场内幕，深觉与他个性格格不入，亟亟掩鼻摇头而去。1902年他便带了26个少年再赴日本，自己仍入高等师范。当时清政府驻日使为蔡均，吴敬恒请求他保闼江苏、浙江、江西自费学生9人入成城学校，那是日本陆军士官学校的预备学校，一年后即可升入士官学校，但蔡均不答应保送。吴敬恒与孙揆均带着26个学生赴使馆与蔡均争论，吴敬恒伶牙俐齿，据理力争，其余在东京的中国留学生亦广为声援，相持至一星期之久。蔡钧恼羞成怒，竟叫日本警察以“妨害治安”罪名，驱逐吴、孙二人出境。吴敬恒气愤异常，写下了绝命书，愤投水自杀，幸被警察所求而未死。在被迫登上法国邮般回国时，正在日本的蔡元培闻讯赶到船上护送他回国。吴敬恒由此事件，意识到清政府的腐败。回到上海后，便在欢迎大会上慷慨陈辞，痛斥清廷腐败，丧权辱国，革命思想由此引发。
1911年，辛亥革命。孙中山从美国至伦敦。吴敬恒与李晓生为孙中山处理大量函电，共商国事，确定青天白日旗为国旗，在伦敦唐人街率先悬挂。孙中山邀他和石瑛从英国经法国、瑞士、意大利乘轮船回到中国。1912年1月4日，他到达南京。临时大总统孙中山留他住总统府，谈商国政，并要授他教育总长之职，他坚决辞却。3月，他与李煜瀛、蔡元培、张人杰、汪兆铭等在上海发起“八不会”和“进德会”，倡导革命党人不做官、不作议员、不饮酒、不吸烟、不食肉、不娶妾等八不运动。随之发起俭学会、送人才到英、法、美等国留学。
1924年1月，出席国民党第一次全国代表大会，他被选为第一届中央监察委员。孙中山约请他担任黄埔军校政治部主任，不就。2月，在上海创立国语师范学校，自任校长。12月，参加北京清室善后委员会，与李煜瀛一同参与点查故宫文物。