菌种分离最常用的方法是孢子分离法、组织分离法和菌料分 离法。孢子分离法：
（1）在生长势强的群体中，选择出菇早、朵形好、个体肥大 、生长健壮、无病虫害、商品性状好、七八成熟（即菌幕将 破而未破）的子实体，将其轻轻采下，切去带泥士的菇根， 装入无菌纸袋，带回无菌接种室（箱）。
（2）把采集到的种菇放入0.1％升汞溶液内约1分钟，用镊子 夹出，再用无菌水冲洗数次，最后用无菌纱布将菇表面的水 吸干。
（3）将种菇插入孢子采集器（提前灭菌干燥）的金属支架上 ，菌褶向下。将孢子采集器放入恒温箱内，在23℃～27℃的 温度下培养1～2天，大量的孢子就会弹落在培养皿内，然后 加盖备用。
（4）把孢子采集器移入灭过菌的接种箱内，取出培养皿，揭 开盖子，加入5毫升无菌水，用无菌注射针管推吸数次，制成 孢子悬浮液。将孢子悬浮液倾斜置于瓷盘边缘，稍经沉淀， 用注射针管吸取培养皿底部的孢子液2～3毫升，再吸2～3毫 升无菌水进一步稀释。
在每支试管的培养基上注入1～2滴孢子液，并将试管稍加旋 转。也可以将孢子液滴注到灭过菌的培养皿中的培养基上。
（5）将试管或培养皿放入恒温箱（室）中，在23℃~27℃下 培养，待孢子萌发后选优汰劣。
（6）在接种箱内进行无菌操作，挑取无杂菌、尖端生长茁壮 的菌丝，转接到另一试管内，放在23℃~27℃的恒温箱（室） 中培养，即成母种。