20世纪20年代，我国的幼儿教育被外国教会所垄断，陈鹤琴对这种“抄袭外人”，“墨守成规、不知改良，以致陈旧腐败不堪闻问”的幼儿教育极为不满，遂于1923年创办了我国第一个幼儿教育实验中心——南京鼓楼幼稚园，进行了幼稚园课程、设备、故事、读法以及幼稚生应有的习惯和技能等项实验研究。归纳起来，主要有以下几方面：其一，读法研究。通过读法实验，证明幼稚园内可以进行读法（识字）教学。儿童学识字和学语言相似，必须采用游戏的方式方法，不能要求幼儿死记符号，而是必须适应幼儿的兴趣和需要。他曾编订了一份《幼儿读法字汇表》计254字。其二，设备研究。他认为设备是为了刺激儿童的身体，提供幼儿游戏活动的条件；设备应为教育、教学服务。他编制了比较完备的和最低程度的两种设备表，并创制了摇船、摇马、小推车、游戏平台等。其三，故事研究。他认为故事能与儿童的情感发生交流作用，离奇的情节能满足儿童的好奇心，激发儿童的想象力，故事组织得完整能适合儿童的学习心理，应充分运用故事作为教育手段。为此，他创编和改编了许多故事。
这里值得特别论述的是陈鹤琴的课程研究。当时幼稚园的课程非常混乱，有教会幼稚园的宗教课程，有蒙养园的日本式课程，也有少数幼稚园实施福禄贝尔、蒙台梭利的课程。陈鹤琴认为，这种大抵抄袭外人的课程，“弄不出什么好的教育来”，决心根据中国的国情，从课程着手，探索改革幼儿教育之路。1925～1928年，经历了由散漫期——理论组织期——中心制期，形成了陈鹤琴的幼稚园课程论，其基本思想是：
课程应为目标服务。他认为“课程与方法都是达到目的的工具，所以谈教育，第一应当解释目的”。在谈目标前，他先确立了“儿童还是教育的主体”的思想。他认为儿童、教材和教师是教育上的三大要素，教师“先测量儿童的个性，希望他们达到怎样的目的，然后选择最适宜的教材，使用最适宜的方法，以达到所希望的目的”。目的有四个方面：做怎样的人；应该有怎样的身体；应该怎样开发儿童的智力；怎样培养情绪。到了40年代，陈鹤琴把目的论概括为“做人，做中国人，做现代中国人”，这集中体现了他的爱国思想和时代精神。
课程应以自然和社会为中心。陈鹤琴主张“把幼稚园的课程打成一片，成为有系统的组织。但是这种有系统的东西，应当以什么为中心呢？这当然要根据儿童的环境”。他认为儿童的环境不外乎两种：一种是自然环境——动植物和自然现象；一种是社会环境——个人、家庭、集社、市廛等类的交往。这两种环境是儿童天天接触到的，就以此作为课程的中心。他反对把儿童关在“幼稚监狱”里过呆板的、死气沉沉的生活，主张让儿童与环境有充分的接触。儿童所接触的环境和社会愈广，所得的知识愈丰富，能力的发展也愈充分。在此基础上，陈鹤琴将“大自然、大社会都是活教材”发展成为活教育的课程论，借以反对以课堂和书本为中心的死教育。
课程应实施“整个教学法”。陈鹤琴认为幼稚园的课程乃幼稚生在园的一切之活动。课程不等于科目。大学生的程度高、知识深，非分科不可的。“而幼稚园的分科教学是四分五裂、杂乱无章的，是违反儿童的生活和儿童心理的”。他提倡“整个教学法”，“就是把儿童所应该学的东西整个地、有系统地去教儿童学”，因为儿童生活是整个的，教材也应当是整个的、互相连接不可分割的。
课程应当采用游戏式、暗示性、小团体式……的教学法。陈鹤琴认为儿童以游戏为生活，儿童总是喜欢游戏的，“凡事当做工作做就是痛苦的，当做游戏做就是快活的”。通过游戏可以发展身体，培养高尚道德，使脑筋敏锐，为休息之灵丹。“幼稚园里的课程很容易游戏化”的，所以幼稚园的课程应当采用游戏式的教导法。陈鹤琴又认为儿童好模仿，易受成人的暗示，幼稚园的课程应采用暗示性的教学法，通过语言、文字、图画、动作进行暗示，尤以教师和家长的以身作则最为重要。陈鹤琴还主张多采用小团体的教学法，他认为幼稚生的年龄不齐，智力不同，兴趣不一致，应当区别对待、分组施教，以使处于不同发展水平的幼稚生都能有所长进。以后，陈鹤琴陆续提出比较法、比赛法、替代法、观察法等，既可以提高教学效果，又使儿童的兴趣格外浓厚。他所提倡的多样化的教学法是符合幼儿身心发展特点的，具有科学性。
课程应当有考查儿童成绩的标准。陈鹤琴认为要回答幼稚园应该教什么，幼稚生做什么，做到什么地步，程度怎样，非得有种种标准不可。“考查品行，应当有品行的标准；甄别习惯，应当有习惯标准；检验技能，应当有技能标准；测验知识，应当有知识标准。”知道幼稚生的成绩，就可以施行相当的教育，扬长补短，促进儿童发展。陈鹤琴等编制了《幼稚生应有的习惯和技能表》，包括卫生习惯，做人的习惯（个人的和社会性的）、生活的技能、游戏运动的技能、表达思想的技能、日用的常识，计185项，开创了我国幼儿教育的评估工作。
陈鹤琴的课程理论产生以后，课程中心制的单元教学遂成为我国二十世纪二十至四十年代幼稚园课程的基本模式，影响遍及全国（直至解放区）。这一改革，使中国的幼儿教育从抄袭外国的宗教色彩中解脱出来，进入了一个崭新的阶段，使课程趋向中国化和科学化，既有扎实的理论基础，又有丰富的实践经验，缩短了我国与国际幼儿教育的差距。
在南京鼓楼幼稚园实验研究的基础上，陈鹤琴于1927年发表了《我们的主张》十五条：幼稚园是要适应国情的；儿童教育是幼稚园与家庭共同的责任；凡是儿童能够学的而又应当学的，我们都应当教他；幼稚园的课程以自然、社会为中心；课程既要事先拟定，又得临时变更；要注意儿童的健康；要使儿童养成良好的习惯；要特别注重音乐；应有充分而适当的设备；应采用游戏式的教学法；幼稚生的户外活动要多；多采取小团体的教学法；教师应当是儿童的朋友；教师应当有充分的训练；应当有种种标准，随时考查儿童的成绩。这十五条主张系统阐明了我国学前教育的方向和任务、课程的中心与组织、教学的方式与方法、师生关系、家园关系以及环境设备等。
陈鹤琴在20世纪的二十至三十年代，主要从事幼稚园教育的研究，除躬行实践教育研究外，还组织群众性的幼稚教育、儿童教育学术团体，创办《幼稚教育》、《儿童教育》、《小学教师》、《活教育》、《新儿童教育》等刊物，主编幼稚教育丛书、儿童科学丛书，编写了多种幼儿教育书籍、幼稚园教材和儿童读物，如《幼稚教育论文集》、《儿童故事》、《儿童游戏》、《儿童唱歌》、《儿童节奏乐》、《幼稚生新谜语》等。创制了许多教具、玩具和体育、游戏用品，如竹制积木、木偶戏道具等。